[发明专利]ELMO2过表达间充质干细胞的构建及其在骨折治疗中的应用

说明书

本发明属于骨折的干细胞治疗技术领域，具体涉及ELMO2过表达间充质干细胞的构建及其在骨折治疗中的应用，本发明根据ELMO2的TSS上游序列设计特异的sgRNA，利用该sgRNA将失去核酸内切酶活性且融合了VP64、p65激活结构域和Rta的dCas9特异地导向ELMO2基因的转录起始位点TSS，通过转录因子的激活作用促进MSCs中ELMO2的转录，成功构建了稳定过表达ELMO2的MSCs，本发明方法可促进MSCs对TNFα趋化作用的敏感性，将MSCs特异性地导向骨折损伤部位，从而提高了MSCs在治疗骨折中的特异性和疗效。

技术领域

本发明属于骨折的干细胞治疗技术领域，具体涉及ELMO2过表达间充质干细胞的构建及其在骨折治疗中的应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是干细胞家族的重要成员，是一群中胚层来源且具有自我更新及多向分化能力的细胞，最早发现于骨髓，在脂肪、羊水、脐血、牙体等组织中也可提取出MSCs。MSCs在标准的组织培养环境中贴壁生长，并表达CD73，CD90和CD105等特定的细胞表面标志物，但缺乏CD45，CD34，CD14，CD11b,CD79α,CD19以及HLA-DR这些特定标志物。同时，MSCs在体外有分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞的能力。由于MSCs自身具有多向分化及免疫调节的特点，使其在细胞输注治疗免疫性疾病及机体损伤方面被广泛应用。目前在全球范围内已有877项MSCs移植被作为细胞疗法的临床研究正在开展。

人体内骨代谢的稳态由骨形成和骨吸收两个过程来维持，其中，MSCs作为成骨细胞的主要来源，介导骨的形成过程，而骨吸收过程则主要由破骨细胞来介导。生理过程中骨形成与骨吸收保持平衡能将骨量维持在一定水平，但当出现骨折创伤时，骨代谢的稳态被打破，进而开始骨修复的过程，即首先在坏死组织和死骨引起炎症，接着形成骨痂并进行塑形完成骨折的修复。此过程中损伤的局部组织产生炎症反应并释放信号分子，激活特定组织及循环中的MSCs，通过趋化作用使MSCs迁移到损伤部位，发挥其成骨分化的骨修复作用，此过程称为归巢。

MSCs本身具备的成骨分化及向损伤局部迁移的能力，使其在作为细胞疗法输注治疗骨折上备受关注。有研究通过静脉注射荧光标记的MSCs可观察到在骨折模型小鼠的损伤部位检测到荧光，提示静脉输注MSCs可定位到骨折部位参与骨痂的形成及骨折端的修复。同时，为了优化MSCs输注促进骨折修复的疗效，有学者通过应用促进MSCs归巢的分子如BMP2、SDF-1、SOX11等促进MSCs迁移到骨折部位部，促进其参与骨折后的组织修复过程。

目前，通过MSCs输注治疗各种疾病(如系统免疫性疾病等)的临床疗效及安全性已经受到了广泛认可，也有许多相关的临床试验正在开展，但MSCs输注治疗骨折损伤的临床应用仍受到很大限制。MSCs通过静脉输注到体内后通过血液循环被带到各个器官中，未经修饰的MSCs细胞表面有多种受体(如CXCR4、CX3CR1等)，可受多种人体微环境因子(如TGF-β、IL-1β、SDF-1等)的刺激，促进MSCs迁移到局部并停留在相应的组织器官中，阻碍其向损伤部位的炎症部位迁移。因此，当MSCs静脉注射时，常因其对损伤部位的炎症因子的刺激特异性不足而滞留在非损伤部位，从而影响对骨折修复的治疗效果。同时，因为MSCs本身具有免疫调节作用，有研究表明MSCs具有抑制多种免疫细胞例(如T细胞、NK细胞、树突状细胞等)的免疫功能，降低免疫细胞本身正常免疫所需要的表面受体和炎症因子的表达，可能导致免疫相关的并发症。针对MSCs输注的上述不足，有学者对MSCs进行修饰以期后提高了其治疗的效果，并取得了一定的进展。有研究报道，通过以慢病毒作为载体在MSCs中过表达CXCR5表面受体，可以提高其对CXCL13趋化因子招募信号的敏感性及特异性，提高其在迁移到接触性皮炎小鼠炎症部位聚集并停留的能力，从而优化MSCs的治疗效果。但目前大多使用慢病毒或腺病毒等病毒作为载体对MSCs进行基因表达的干预，因慢病毒及腺病毒是病毒来源，有潜在的危险性，因此现有的基因修饰手段在临床应用上仍具有一定的局限性。因此，有必要开发一种新的MSCs修饰方法，以提高其用于临床的可行性和安全性。

发明内容