[发明专利]一种采用三联PCR检测猪PRV、PRRSV、PCV2的试剂及方法

权利要求书

1.一种采用三联PCR检测猪PRV、PRRSV、PCV2的试剂，其特征在于，包含能扩增PRV的gE基因、PRRSV的M基因和PCV2的ORF2基因的三对特异性引物，其中P1和P2引物扩增gE基因片段，扩增长度为178bp，P3和P4引物扩增M基因片段，扩增长度为363bp，P5和P6引物扩增ORF2基因片段，扩增长度为494bp；

所述引物序列为如下核苷酸序列：

P1：SEQ ID NO：1；

P2：SEQ ID NO：2；

P3：SEQ ID NO：3；

P4：SEQ ID NO：4；

P5：SEQ ID NO：5；

P6：SEQ ID NO：6。

2.根据权利要求1所述的一种采用三联PCR检测猪PRV、PRRSV、PCV2的试剂，其特征在于，包括10×PCR缓冲液2μL，2×GC缓冲液(Mg²⁺5mmol/L)10μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg²⁺溶液1.5μL，20μmol/L P1、P2混合物0.4μL，20μmol/L P3、P4混合物1.2μL，20μmol/L P5、P6混合物0.6μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH2O1.9μL。

3.一种采用三联PCR检测猪PRV、PRRSV、PCV2试剂的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)PRV的gE基因、PRRSV的M基因和PCV2的ORF2基因序列的选择：从GenBank数据库中下载已经发表的8株PRV的gE基因序列、10株PRRSV的M基因序列和14株PCV2的ORF2基因序列分别进行同源性分析，选择同源性高的作为靶序列；

(2)根据选择的gE基因、PRRSV的M基因和PCV2的ORF2基因的靶序列，用PCR引物设计软件分别进行引物的设计，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，得到3对最佳引物：P1、P2，P3、P4及P5、P6，用全自动DNA合成仪进行引物的合成，其中P1和P2引物扩增gE基因片段，扩增长度为178bp，P3和P4引物扩增M基因片段，扩增长度为363bp，P5和P6引物扩增ORF2基因片段，扩增长度为494bp；

所述引物序列为如下核苷酸序列：

P1：SEQ ID NO：1；

P2：SEQ ID NO：2；

P3：SEQ ID NO：3；

P4：SEQ ID NO：4；

P5：SEQ ID NO：5；

P6：SEQ ID NO：6。

4.一种采用三联PCR检测猪PRV、PRRSV、PCV2的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)样品的处理；

(2)病料样品DNA的提取；

(3)三联PCR反应：

采用25μL PCR反应体系；PCR反应体系的组成为：10×PCR缓冲液2μL，2×GC缓冲液(Mg²⁺5mmol/L)10μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg²⁺溶液1.5μL，20μmol/L PRV引物混合物0.4μL，20μmol/L PRRSV引物混合物1.2μL，20μmol/L PCV2引物混合物0.6μL，病料样品中提取的DNA 3μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH2O1.9μL；PCR反应条件为：95.5℃，5min，95℃，30s，57℃，45s，共35个循环，最后72℃延伸5min；

(4)结果判定

取三联PCR产物在琼脂糖凝胶上，电泳后在紫外光透射仪下观察拍照，以标准DNAmarker(D,L-2000)作参考；电泳后，若琼脂糖凝胶中同时出现3条核酸带，且片段大小分别为178bp，363bp和494bp，说明病料样品中同时含有PRV、PRRSV、PCV2病毒；如果仅出现其中一个或者两个对应长度的核酸片段，则表明病料样品中只含有其中一种或两种病毒；若不出现任何核酸片段，则表明病料样品中不含有PRV、PRRSV、PCV2病毒。

5.根据权利要求4所述的一种采用三联PCR检测猪PRV、PRRSV、PCV2的方法，其特征在于，步骤(4)中，取8μl产物于1.5％琼脂糖凝胶上75V电泳30分钟。