[发明专利]一种来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。本发明筛选获得了来源于光伏希瓦氏菌(Shewanella loihica)的甜味蛋白，该甜味蛋白在大肠杆菌中无需进行结构改造即可高效表达，且具有较高的甜度和较好的稳定性，甜味阈值为200μg/mL，以4mg/mL的蔗糖溶液为标准，该重组蛋白相对蔗糖甜度为其20倍。

技术领域

本发明涉及一种来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，越来越多的人罹患肥胖、糖尿病、高血脂、龋齿等疾病，由于不能正常代谢糖类，在正常餐食中不得不食用低卡路里的人工甜味剂，如糖精、天冬甜素、环磺酸盐等代糖。然而，这些人工甜味剂会引发精神错乱、膀胱癌、·心血管疾病以及脑瘤等疾病。甜味蛋白是一类具有甜味高、热量低等特性的非糖类甜味剂，可被人体降解为氨基酸，且吸收和利用不依赖于胰岛素，因此，有望成为良好的天然甜味添加剂。

目前已知的甜味素蛋白均分离自热带雨林植物，包括Brazzein,Thaumatin,Monellin,Curculin/Neoculin,Mabinlin,Miraculin,Pentadin，其中Thaumatin和Monellin的甜度最高，是等重量蔗糖甜度的3000倍。然而，由于产地和资源限制，植物引种难以成功，以及分离纯化工艺复杂、回收率低、杂质多等原因，天然提取甜味蛋白难以满足食品、药品工业需求。据发明人所知，仅Thaumatin可从原生植物的奇异果中提取，已少量应用于制药和化妆品行业；Monellin的提取量无法达到工业生产需求。

研究人员尝试使用转基因生物生产大量的甜蛋白，但结果并不理想，尽管获得了具有甜味的转基因土豆、黄瓜、草莓、番茄、玉米等，但这些产品都是作为直接食用的食品，同时由于重组表达产量较低，未能作为原材料进行分离提取制备甜味蛋白。也有研究者尝试在微生物中表达甜味蛋白，尽管重组蛋白均成功表达，但由于宿主微生物细胞的蛋白表达系统与植物的差异，重组蛋白甜味消失，不得不进一步通过定点突变增加甜味蛋白分子表面正电荷数、引入发卡结构改变其三维结构等方案增加其稳定性和甜度。目前未见以基因重组方式实现甜味蛋白大规模生产的报道。

发明内容

本发明提供了来源于光伏希瓦氏菌的甜味蛋白2GPI及其在作为甜味剂方面的新用途。

本发明提供了一种编码甜味蛋白2GPI的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供携带所述基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述质粒为pET系列质粒。

本发明还提供了表达甜味蛋白2GPI的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述甜味蛋白2GPI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述甜味蛋白2GPI的制备方法，包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.2所示的基因与表达载体pET22b相连接，得到重组表达载体；

(2)将所述重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌BL21，得到重组表达细胞；

(3)培养所述重组表达细胞，并利用IPTG诱导表达重组蛋白；

(4)收集培养液上清中的重组蛋白并利用镍亲和层析柱纯化，即得甜味蛋白2GPI。

在一种实施方式中，步骤(1)具体为：以pET22b为表达载体，利用BamH I和HindIII分别对SEQ ID NO.2所示的基因和表达载体pET22b进行双酶切，回收酶切片段，以T4DNA连接酶连接，获得重组表达质粒。