[发明专利]一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组硫酸软骨素酶ABC‑I蛋白及其制备方法与应用。本发明使用分子克隆技术通过提取硫酸软骨素酶ABC‑I基因设计引物，经PCR扩增后与表达载体连接，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至大肠杆菌，构建重组表达转化体，实现重组硫酸软骨素酶ABC‑I蛋白的可溶性表达。构建过程操作简单，成本低。所构建的重组硫酸软骨素酶ABC‑I蛋白表达量高、具有较高的酶活性，粗酶活性可达到7144U/L，经Ni‑NTA纯化后，酶活力为492.1 U/mg；且稳定性好，37℃下的半衰期为120 min，在4℃下的半衰期为112天。在生产低分子量硫酸软骨素中具有较高的应用价值，在医药、环保等领域上前景广阔。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

硫酸软骨素（chondroitin sulfate）是一类糖胺聚糖(GAGs)的阴离子生物大分子，通常以共价连接到蛋白质。在包括神经元发育、凝血、炎症、细胞运输、细胞增殖和肿瘤发生等过程中起着重要作用。硫酸软骨素作为结缔组织中天然存在的成分，能够与水分子结合从而起到润滑和支撑关节的作用，使关节能够活动自如，减轻关节疼痛。此外，它还被证明可作为具有乳化特性的食品防腐剂使用，并可用于营养配方，以预防和减少骨关节炎。硫酸软骨素需要在细胞内起作用，但它的大分子体积会影响其顺利穿过细胞表面的一层薄膜，而无法在机体内发挥出其多种良好的药理功能。低分子量的硫酸软骨素因具有溶解性好及生物利用度高等优点具有更好的生物化学特性。

硫酸软骨素ABC裂解酶(Chon-ABC，EC 4.2.2.4)是一类具有广泛特异性的糖胺酶，通过β-消除反应降解硫酸软骨素糖胺聚糖(GAGs)。根据裂解机理，Chon-ABCs分为内源性消除酶(Chon-ABC-I，能将硫酸软骨素解聚为不饱和的四糖和二糖)和外源性消除酶(Chon-ABC-II，能将硫酸软骨素六四糖降解为二糖)。Chon-ABC-I因在硫酸软骨素低聚糖降解方面的应用具有很好的医用前景。主要通过发酵和纯化工艺制备硫酸软骨素酶ABC-I，但存在酶活性低、生产繁琐、成本高等问题。为了增加可溶性表达和活性，引入分子伴侣蛋白用于异源表达。但其生产仍然繁琐，且存在表达过程中包涵体形成、蛋白回收率低等问题。目前尚缺乏一种低成本、高稳定性的硫酸软骨素酶ABC-I制备工艺。

发明内容

有鉴于此，本发明通过分子克隆的方法提供一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用。本发明的重组硫酸软骨素酶ABC-I具有较高的酶活力及稳定性能，制备方法简单、成本低，可用于工业化生产低分子量的硫酸软骨素酶ABC-I。

本发明的方案通过如下技术手段得以实现：

本发明提供了一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码1006个氨基酸，分子量108 kDa。

另一方面，本发明还提供了编码上述硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的一种氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的构建方法，具体包括如下步骤：

（1）以多形拟杆菌硫酸软骨素酶ABC-I基因组为模板，采用分别带有NdeI和XbaI酶切位点及5’端保护碱基为引物，按照常规方法进行PCR扩增编码获得目的基因片段；

（2）将目的基因片段与表达载体pCznl连接构建硫酸软骨素酶ABC-I基因的pCznl-Chon-ABC-I重组表达载体；

（3）将步骤（2）中构建的pCznl-Chon-ABC-I重组表达载体转化进入大肠杆菌宿主菌中，构建硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌；

（4）硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌中重组硫酸软骨素酶的诱导表达；

（5）分离纯化步骤（4）所得的表达产物，获得重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白。