[发明专利]一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白，其特征在于，所述重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码1006个氨基酸，分子量108 kDa。

2.根据权利要求1所述的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以多形拟杆菌硫酸软骨素酶ABC-I基因组为模板，采用分别带有NdeI和XbaI酶切位点及5’端保护碱基为引物，按照常规方法进行PCR扩增编码获得目的基因片段；

（2）将目的基因片段与表达载体pCznl连接构建硫酸软骨素酶ABC-I基因的pCznl-Chon-ABC-I重组表达载体；

（3）将步骤（2）中构建的pCznl-Chon-ABC-I重组表达载体转化进入大肠杆菌宿主菌中，构建硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌；

（4）硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌中重组硫酸软骨素酶的诱导表达；

（5）分离纯化步骤（4）所得的表达产物，获得重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述引物的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述PCR扩增的反应参数为：95℃起始变性4 min，95℃变性30 s，60℃退火55 s，72℃延伸1 min，循环20次，72 ℃延伸10 min。

6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述的目的基因片段与表达载体pCznl均分别使用NdeI和 XbaI进行双酶切处理。

7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述连接的条件为25℃，12小时；连接体系为：载体2 μL，目的基因6 μL，10×Ligation buffer 1 μL，T4DNA连接酶1 μL。

8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中所述的诱导表达为：硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌接种到5 mL含有终浓度50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜制得种子液，将种子液接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6~0.8后，添加终浓度为0.75 mM的IPTG在25℃下振荡6 h。

9.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（5）中所述的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的分子量为108 kDa。

10.一种如权利要求1所述的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在制备低分子量硫酸软骨素中的应用。