[发明专利]基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用

说明书

本发明属于分子遗传学领域，涉及红麻植株不同胞质的鉴别，特别是指基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用。方法为：称取待鉴别红麻花药，并提取RNA；将提取的RNA进行自连后形成RNA环化产物；将环化产物反转录成cDNA；设计目的线粒体基因已知序列的5’端3’端反向巢氏引物，进行两轮反向巢氏PCR，经凝胶电泳检测后，回收第二轮巢氏PCR产物进行测序；将测序结果与目的线粒体基因的CDS保守区域进行对比分析，获得目的线粒体基因的CDS全长、及5’至3’端转录本全长；对线粒体基因的CDS全长和/或转录本全长的序列特点进行分析，鉴别红麻不同类型的胞质。本发明还可应用于目的基因在不同材料处理、或不同品种间转录本丰度和转录本末端的比较研究。

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及红麻植株不同胞质的鉴别，特别是指基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用。

背景技术

目的基因全长获取和转录本特征分析是基因功能研究和表达调控的前提基础。近年来，全基因组测序和转录组测序为生物体基因的特征分析和表达分析调控研究提供了良好的技术方法，但是对于绝大多数生物而言，尚未获得全基因组序列，某些基因的全长序列也未知；通过转录组方式研究单个目的基因的表达调控成本过高，而且转录组数据中存在大量与目的基因表达不相关的冗余信息。传统方法通过RACE试剂盒或TAIR-PCR获取目的基因序列，由于RACE试剂盒昂贵、成本高，步骤繁琐，易使mRNA在操作过程中损失或降解；TAIR-PCR方法只有一端是基因特异引物，而另一端是随机简并引物，PCR扩增产物成功率较低、特异性不强等特点，很难满足后续实验需求。

Weston Blot是研究基因转录本表达的传统方法，但该方法操作周期长、步骤繁琐，并且对一些低丰度表达的转录本难以精确检测；此外，Weston Blot方法也无法对所检测基因的转录本条带进行回收测序分析。

专利CN 201110195025.8公开了利用巢式PCR结合基因特异引物的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法与应用，该方法基于3’GSP1的反转录PCR，利用梯度PCR寻找每个基因每对引物组合的最佳退火温度，基于GSP的巢式PCR测序并基于序列分析判定是否为新的剪接变体。

基于现有的研究可知，扩增目的基因的全长的方法有多种，而且研究人员在现有方法的基础上针对要解决的技术问题，往往需要对方法进行改进。本申请为解决如何通过线粒体基因转录本差异来鉴别红麻不同胞质的技术问题，对现有的技术方法，进行了改进和摸索。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法，步骤为：

（1）称取待鉴别红麻花药，并提取RNA；

（2）将步骤（1）提取的RNA进行环化处理，然后RNA环化产物反转录形成cDNA；

（3）在目的线粒体基因保守区域的5’和3’端分别设计两对反向巢氏引物，进行两轮反向巢氏PCR，经凝胶电泳检测后，将第二轮巢氏PCR产物进行回收测序；

（4）将测序结果与目的线粒体基因的CDS保守区域进行对比分析，通过ORF finder在线软件和同源序列比对分析获得目的线粒体基因的CDS全长、及该线粒体基因的5’至3’端转录本全长；

（5）对步骤（4）获得的线粒体基因的CDS全长和/或5’至3’端转录本全长的序列特点进行分析，鉴别红麻不同胞质。