[发明专利]基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用

权利要求书

1.基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻品种是否受核质互作调控的方法，其特征在于，步骤为：

（1）称取待鉴别红麻花药，并提取RNA；

（2）将步骤（1）提取的RNA进行环化处理，然后对RNA环化产物进行反转录形成cDNA；

（3）在目的线粒体基因保守区域的5’和3’端分别设计两对反向巢氏引物，进行两轮反向巢氏PCR，第一轮PCR反应以经RNA环化后反转录的cDNA为模板，用距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物组合成引物对AP1/SP1，进行PCR扩增反应；第二轮PCR反应第一轮的PCR产物为模板，用距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物组合成引物对AP2/SP2，进行PCR扩增反应，经凝胶电泳检测后，将第二轮巢氏PCR产物进行回收测序；所述目的线粒体基因为atp1，atp9和cox3；

（4）将测序结果与目的线粒体基因的CDS保守区域进行对比分析，通过ORF finder在线软件以及同源序列比对获得目的线粒体基因的CDS全长、及该线粒体基因的5’至3’端转录本全长；

（5）对步骤（4）获得的线粒体基因的CDS全长和/或5’至3’端转录本全长的序列特点进行分析，鉴别红麻不同胞质；所述步骤（5）中鉴别红麻不同胞质的标准为：以atp1为线粒体目的基因时，atp1在不育系胞质中扩增出三条特异条带，在保持系胞质中只有一条特异条带，而在F₁胞质中有两条特异条带；以atp9为线粒体目的基因时，在不育系中扩增出一条大小为400 bp的特异条带，在保持系和F1代中扩增的特异条带大小为450 bp；以cox3为线粒体目的基因时，cox3在不育系胞质中扩增出5条特异条带，且弱带均在两主带之间，在保持系中只有一条特异条带，在F1代中有两条相邻的主带。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的线粒体基因为atp1时，距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物分别为atp1-AP1和atp1-SP1、距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物分别为atp1-AP2和atp1-SP2，其中atp1-Ap1序列为5’-CGATCTCATCCACTTGAAAATTCGT-3’，atp1-AP2序列为5’- TTAGTTCTGCAGCTCTGGGAGAGA-3’，atp1-SP1序列为5’- GGCTTACAGAAGTACCGAAACAACC-3’，atp1-SP2序列为5’-GGATTCTGTGATCGAATGCCATTAG-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的线粒体基因为atp9时，距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物分别为atp9-AP1和atp9-SP1、距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物分别为atp9-AP2和atp9-SP2，其中atp9-AP1序列为5’- GCACCCATTAATTTTGCACCTTC-3’，atp9-AP2序列为5’- ATTCTCGTCACGCGCTTTATCATTC-3’，atp9-SP1序列为5’- ATTTTGGGCTTTGCTCTAACCGAAG-3’，atp9-SP2序列为5’-GAAGCTATTGCATTGTTTGCCCTAA-3’。