[发明专利]一种快速检测氨基葡萄糖的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测氨基葡萄糖的方法。本发明的方法包括配制N‑乙酰氨基葡萄糖溶液，在溶液中加入没食子蓝，得到没食子蓝检测试剂；向含有氨基葡萄糖生产菌株的发酵液中加入没食子蓝检测试剂，培养后检测荧光强度，根据荧光强度降低判断氨基葡萄糖含量。本发明快速检测氨基葡萄糖的方法，主要应用于测量发酵液中，可将底物N‑乙酰氨基葡萄糖转化为氨基葡萄糖的己丁二糖脱乙酰酶的总催化活性。与现有的邻苯二甲醛检测方法不同，本发明的检测方法仅需一步添加试剂混合操作，培养后即可由酶标仪进行检测。相较于现有方法，本方法简单高效，可以明显提升实验效率。

技术领域

本发明涉及一种快速检测氨基葡萄糖的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

氨基葡萄糖是一种广泛存在于自然界的小分子单糖，在医药和保健品等领域有广泛的应用。目前，工业上生产氨基葡萄糖主要采用化学水解法，此方法以虾蟹壳中的甲壳素为底物，使用强酸进行水解，反应条件苛刻、易造成环境污染且生产效率有限。随着绿色化学、环保制造的提倡，更多的研究开始关注绿色环保的微生物发酵技术，并以甲壳素、葡萄糖等廉价产品为底物，通过水解或合成等方式生产氨基葡萄糖。其中，己丁二糖脱乙酰酶可以将相对廉价的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰水解，得到氨基葡萄糖。

为了提高氨基葡萄糖的产量，需要对表达己丁二糖脱乙酰酶重组菌株进行工程改造以提高酶表达量；同时，也可以对酶本身进行定向进化提升其催化活性。然而，不论是哪一种改造方式，都需要一种可以快速对产物氨基葡萄糖的检测方法，以提升改造的实验效率。

目前，对氨基葡萄糖的检测主要使用邻苯二甲醛检测试剂。其配置方法为：称取邻苯二甲醛50mg，加入到100mL，pH为10.5，浓度为100mmol/L的碳酸钠缓冲液中，再加入1mL无水乙醇和浓度为2mol/L的二硫苏糖醇50μL，混合均匀，现用现配。其具体检测方法为：1.取发酵液，于12,000转离心2分钟，取上清；2.取100μL上清液加入100μL，pH为8.0，浓度为100g/L，已于40℃预热的N-乙酰氨基葡萄糖溶液中，混匀，反应2分钟；3.加入100μL，浓度为0.5mol/L的盐酸溶液终止反应；4.取5μL反应液，加入95μL，pH为8.0的磷酸缓冲液中，混匀；5.从缓冲液中取5μL液体，加入到95μL OPA检测试剂中，震荡1min，利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值。对照组使用培养基代替发酵液，其余操作相同。

该检测方法虽然可以较为准确的检测出经催化反应后生成氨基葡萄糖的含量，但在检测过程中需要进行离心、混合、终止、稀释、检测等多步操作，操作繁琐且消耗大量试剂及试管。在对重组菌株和己丁二糖脱乙酰酶进行工程改造时，往往会产生大量不同的突变体。在对大量发酵液进行检测时，该检测方法由于自身操作的复杂性，难免会影响实验的效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种快速检测氨基葡萄糖的方法，仅需一步添加试剂混合操作，培养后即可由酶标仪进行检测。

本发明的第一个目的是提供一种快速检测氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：

S1、配制N-乙酰氨基葡萄糖溶液，在溶液中加入没食子蓝，得到没食子蓝检测试剂；

S2、向含有氨基葡萄糖生产菌株的发酵液中加入没食子蓝检测试剂，培养后检测荧光强度，根据荧光强度降低判断氨基葡萄糖含量。

进一步地，所述的氨基葡萄糖生产菌株是表达己丁二糖脱乙酰酶的菌株。

进一步地，所述的没食子蓝检测试剂中N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为50～150g/L。

进一步地，所述的没食子蓝检测试剂中没食子蓝的浓度为50～150μmol/L。

进一步地，所述的N-乙酰氨基葡萄糖溶液的pH为7.5～8.5。

进一步地，S2步骤中，培养的条件是在35～38℃培养5～20分钟。