[发明专利]一种具有靶向性的CpG核酸药物递送系统及其制备方法

说明书

本发明公开了一种具有靶向性的CpG核酸药物递送系统及其制备方法，属于生物医药领域。本发明CpG核酸药物递送系统包括载体及CpG核酸药物，其中所述载体通过特定方式制得的水溶性氨化酵母β‑1,3‑D‑葡聚糖，该类水溶性氨化酵母β‑1,3‑D‑葡聚糖表面带有较高的正电荷，可与CpG可通过静电作用紧密结合；该载体低毒，生物相容性好，能够通过与其特异性识别受体Dectin‑1结合靶向巨噬细胞；流式细胞术及激光共聚焦扫描显微镜分析显示有高的转染效率。本发明得到的低毒且生物相容性良好的CpG核酸药物递送系统能够实现CpG核酸药物的靶向递送，提高细胞摄取效率。

技术领域

本发明涉及一种具有靶向性的CpG核酸药物递送系统及其制备方法，属于生物医药领域。

背景技术

CpG寡核苷酸(以下简称CpG ODN)是一种富含未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的DNA。未甲基化的CpG基序广泛存在于细菌或病毒的基因组DNA中，且出现频率远远高于脊椎动物，而且脊椎动物中80％的胞嘧啶第5位碳原子是甲基化的，这种显著差异使CpG ODN可以被哺乳动物免疫系统视作“危险信号”而发起免疫应答。CpG ODN能够被免疫细胞的Toll样受体9(以下称TLR9)识别促使细胞分泌各种细胞因子，诱导先天的或者适应性的免疫应答，可作为有效的免疫治疗工具，在抗感染免疫、癌症治疗、过敏性疾病以及免疫佐剂等领域具有重要的应用价值。

由于CpG ODN本质是脱氧核苷酸，具有磷酸二酯键骨架结构，在血液中极易被核酸酶降解，稳定性低；并且在生理环境下寡核苷酸分子所带的负电荷导致细胞摄取的效率低。因此为了提高CpG ODN的稳定性和摄取率，构建药物递送载体将其负载，形成CpG ODN的药物递送系统。近年来，纳米技术的发展为解决核酸药物的递送问题提供了新的工具，已有大量研究报道显示，纳米材料负载的CpG核酸药物表现出高活性、低毒性、生物相容性好等特点不仅能够提高CpG ODN在血清中的稳定性还能提高免疫细胞对CpG ODN药物递送系统的摄取率，有望作为新型免疫治疗制剂应用于相关疾病的预防和治疗中。

酵母β-葡聚糖(Yeastβ-glucan)是以β-1,3-D-葡聚糖为主链，以β-1,6-D-葡聚糖为支链的高分子多糖，主要存在于酵母细胞壁的内层。酵母β-葡聚糖能够通过与其特异性受体Dectin-1结合，刺激免疫细胞，引起一系列免疫反应，刺激免疫系统分泌细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1)等，因此酵母β-葡聚糖酵母是一种具有生物活性的免疫增强剂，具有很强的免疫刺激活性及抗肿瘤活性。基于酵母β-葡聚糖与Dectin-1之间的识别作用，酵母β-葡聚糖可以作为靶向免疫细胞的特殊材料用于构建靶向载药系统，尤其是CpG ODN等具有免疫刺激的核酸药物。酵母β-葡聚糖是天然的多糖纳米载体具有无毒、良好的生物相容性和免疫活性的优点。经过氨基化修饰后，得到氨基化酵母β-葡聚糖作为CpG ODN的靶向载药系统，能显著提高转染效率。

发明内容

本发明通过新奇的合成方法得到较好取代度的氨基化修饰酵母β-葡聚糖，表面富有正电荷的葡聚糖衍生物，载体能够与CpG ODN紧密结合形成50～300nm的复合物。被巨噬细胞膜表面的Dectin-1识别，在RAW264.7细胞中，复合物的细胞摄取率明显提高且几乎超过PEI，并且该材料制备工艺简单、无毒，且具有良好的生物相容性。因此，氨基化葡聚糖衍生物有望成为一种具有靶向性的CpG ODN递送载体，应用于相关疾病的预防和治疗。

本发明的第一个目的是提供一种制备CpG ODN递送系统的方法，所述方法包括如下过程：

(1)通过羟基活化剂活化β-葡聚糖纳米粒子上的羟基，再与含双伯胺的化合物进行反应，得到氨基化β-葡聚糖纳米粒子(NH₂-Glucan)；所述羟基活化剂为NaH和N,N-羰基二咪唑(CDI)；

(2)利用所得氨基化β-葡聚糖纳米粒子作为载体，配制成分散液，然后与含有CpGODN的溶液混匀，通过静电作用将CpG ODN装载在载体中，获得CpG ODN递送系统。