[发明专利]一种全细胞催化制备4-羟基异亮氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种全细胞催化制备4‑羟基异亮氨酸的方法，属于生物技术领域。本发明利用全细胞催化法制备4‑HIL，所述全细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主、以pET28a为载体表达异亮氨酸双加氧酶，以异亮氨酸为底物构建全细胞催化体系进行转化反应，将转化液进行超滤、离子交换后，再经脱色、浓缩、干燥得到4‑HIL产品。本发明底物转化率可以达到98％，结合超滤和离子交换手段，产品中4‑HIL的纯度可以达到98％。

技术领域

本发明涉及一种全细胞催化制备4-羟基异亮氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

4-羟基异亮氨酸((2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine,4-HIL)是一种新型胰岛素分泌促进剂，可用于治疗Ⅱ型糖尿病。L-4-羟基异亮氨酸是存在于胡芦巴属植物中的一种非蛋白氨基酸，这种氨基酸主要存在于胡芦巴种子中，约占该种子中游离氨基酸总含量的80％。传统中药胡芦巴应用于治疗晚期糖尿病、消化不良、胃溃疡、消化紊乱、肿瘤、痛经、体虚、过敏、神经衰弱、痛风和关节炎等。

除了从葫芦巴种子中提取分离，4-HIL的合成方法主要有化学-酶法和酶催化法。L-异亮氨酸羟化酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)能够特异性催化异亮氨酸生成(2S,3R,4S)-4-HIL。化学-酶法合成4-HIL的步骤复杂，中间副产物多且转化效率较低。以表达L-异亮氨酸羟化酶的基因工程菌催化异亮氨酸合成4-HIL，转化率还比较低，且后续的分离纯化效率低。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有的化学-酶法合成4-HIL时，步骤复杂、转化效率低。

[技术方案]

本发明提供了一种利用全细胞催化法制备4-HIL的方法，所述全细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主、以pET28a为载体表达异亮氨酸双加氧酶，以异亮氨酸为底物构建全细胞催化体系进行转化反应，将转化液进行超滤、离子交换后，再经脱色、浓缩、干燥得到4-HIL产品。

所述异亮氨酸双加氧酶可以选择来源于枯草芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶。

所述方法包括以下步骤：

(1)对重组大肠杆菌进行发酵培养，收集得到菌体；

(2)将菌体细胞、底物、缓冲液混合，于28-32℃条件下，转化20-24h，得到转化液；转化体系中，菌体细胞的浓度是120-180g/L，异亮氨酸的浓度是80-100g/L、α-酮戊二酸的浓度是80-120g/L、Vc的浓度是8-12g/L、七水合硫酸亚铁0.3-1.0g/L；Vc作为还原剂，七水合硫酸亚铁作为辅因子；

(3)将转化液利用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体，得到超滤膜清液；

(4)对清液进行离子交换处理，采用的离子交换柱是732阳离子交换树脂，并用1-2％的氢氧化钠溶液进行洗脱；洗脱液的折光≥0.1时开始收集，收集电导率≤1000us/cm的洗脱液；

(6)向洗脱液中添加12-15％的活性炭，于55-60℃脱色30min-60min，抽滤、浓缩，干燥得到4-HIL产品。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，称取异亮氨酸90g、α-酮戊二酸100.5g、Vc10.6g、七水合硫酸亚铁0.45g，加自来水溶解，倒入5L发酵罐中，调节料液pH至7.0，加入离心后菌体用量150g，自来水补足至3L，加入泡敌0.5mL，转化条件：30℃，250rpm，1vvm通气量反应，反应24h。