[发明专利]一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ载体进行改造，以BeYDV双生病毒中复制子元件为载体，将sgRNA序列构建在复制环内，构建了在棉花中具有基因编辑功能的载体BeYDV‑Cas9，选取GhCLA为目标基因验证BeYDV‑Cas9在棉花中的应用，并且设计1个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将BeYDV‑Cas9基因编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行Sanger测序，检测本发明在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率类型，从而有效的解决了传统的CRISPR‑Cas9系统在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行有效编辑工具的问题。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体为一种适用于陆地棉的基因精 准高效编辑的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromicrepeats/CRISPRassociated protein)是细菌和古菌在抵御外来病毒和噬菌体 入侵的过程中不断迚化而来的一种获得性免疫防御机制，CRISPR/Cas9系统是 目前应用最多最广泛的基因编辑系统，能够高效特异和灵活的识别靶基因中 的特定位点，然而，随着研究的不断深入，CRISPR/Cas9也暴露了比较严重的 脱靶效应(Hsu et al 2014)、PAM序列的限制导致其切割位点较少及基因编 辑后后代不易纯合等缺陷，因此需要改造CRISPR/Cas9系统，降低其脱靶效 应，提高基因编辑精准度，扩大靶标位点范围，寻找新的基因编辑系统。

Geminivirus是一类拥有众多成员的植物病毒，它们的基因组由2.5-3kb 的单链环状DNA组成，能浸染大多数单子叶和双子叶植物，并且能被改造成 HDR所需的供体分子，当Geminivirus浸染植物细胞后，它们具有快速浸染、 增殖、转录、表达而不整合入植物基因组的特点，从使得细胞内以滚环复制 的方式产生大量的供体分子，数量可高达数百至数千拷贝，一次，将生病毒 在植物体内滚环复制提供大量sgRNA模板，可大量增加植物体内的Cas9蛋白 和sgRNA含量可以有效的促进在植物基因组中精确高编辑。

目前，BeYDV介导的基因编辑系统系统在很多物种中被报道，但是在异源 四倍体棉花中尚无报道，陆地棉是一种广泛种植的异源四倍体(AtDt)，其基 因组中的许多基因具有高度同源性，并且基因组比较复杂及庞大，传统的 CRISPR-Cas9系统在需要对某些特定基因进行编辑及功能分析时无能为力，其 并无可行而又有效的精准编辑工具，为棉花基因组功能分析，作物遗传改良 和新品种选育提供重要技术支持，因此难以满足社会需求，故而提出一种适 用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法来解决上述中所提出的问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于陆地棉的基因精准高效 编辑的方法，具备可精准编辑基因等优点，解决了传统的CRISPR-Cas9系统 在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行有效编辑工具的问题。

(二)技术方案

为实现上述可精准编辑基因的目的，本发明提供如下技术方案：一种适 用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序 列如SEQID NO:2所示，该载体通过下列步骤制备获得：

1)、获得目的序列复制子元件(BeSRL)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 3所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：