[发明专利]一种微生物源双链RNA的快速制备方法

说明书

一种微生物源双链RNA的快速制备方法，通过将靶标基因插入含有T7启动子的表达型载体，将含靶标基因的表达载体转化至RNase III缺陷型大肠杆菌HT115(DE3)，获得表达菌株；将表达菌株加入含有氨苄青霉素和四环素的TB液体培养基中，摇床过夜培养，再转接菌液至TB培养基，摇床培养后加入IPTG诱导剂，诱导17‑22h后结束发酵；将重组菌细胞悬浮于高盐浓度的TE缓冲液中，破碎细胞经过60‑80℃加热40‑60min后，离心获得dsRNA生物制剂。本发明提高了dsRNA的合成效率，降低生产成本，dsRNA的最终产量能达到17.90±4.20μg/mL。

技术领域

本发明属于农业病虫害防治领域，具体涉及一种微生物源双链RNA的快速制备方法。

背景技术

随着全球化的进行和环境变化，加剧了病虫害的分布和扩散，严重威胁人类的粮食安全问题，也迫使人们去开发新型可持续的病虫害防治策略。

RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)是一项颇具潜力的绿色防控策略，可以选择任一基因作为靶标，能专一性地抑制靶标基因的实质表达，在线虫、节肢动物、植物病毒、真菌和其他病原菌等病虫害的防治方面均有大量研究报道。

RNAi途径是所有真核生物中控制基因表达水平的一种转录后调控方式，外源和内源的双链RNA(dsRNA)都可以诱导RNAi，从而特异性降解靶标mRNA分子。利用这一机制，可以开发出一整套可利用的害物防治方法，其中包括传统的转化形式即转基因植物，以及将dsRNA加工成不同制剂的形式。相比于转基因形式，后者相对开发成本低，不受转基因监管的限制，具有很好的产品开发应用前景。

目前RNAi在农作物保护方面的研究还面临诸多挑战，其中至关重要的一个便是如何廉价地制备大量的dsRNA以解决农业应用中的成本问题。目前，dsRNA的大量合成方法主要有体外酶法和微生物发酵法。

体外酶法主要利用T7噬菌体的DNA依赖型RNA聚合酶(DdRP)对特定的DNA模板进行转录并进行单链RNA退火杂交后获得dsRNA，该方法通常需要获得价格昂贵的T7 RNA聚合酶。

微生物发酵法是目前降低dsRNA成本最可行的方法，大量RNAi实验证实，可以利用RNase II缺陷型和DE3溶源的大肠杆菌合成dsRNA，但对其合成效率和产量研究较少。

目前，微生物源dsRNA用于生物农药的制剂一般直接采用菌体或者细胞破碎液，没有除杂和保护剂添加等措施，这不利于dsRNA生物制剂的生物防护效果和保存，而实验用的较纯的dsRNA制剂则需要将破碎后的细胞经过酚氯仿抽提、DNase和RNase I酶解、色谱柱纯化等处理，步骤复杂，产量低。目前报道的微生物工程菌中dsRNA最高产量为6.2μg/mL。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物源双链RNA的快速制备方法，构建具有高表达量的表达菌株，优化大肠杆菌HT115(DE3)工程菌表达dsRNA的发酵条件，改进了工程菌发酵结束后dsRNA的分离提取和制剂方法，提高dsRNA的合成效率并进行快速提取，降低生产成本，为其在农业病虫害防治上的大规模应用提供保障。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种微生物源双链RNA的快速制备方法，包括：

1)构建表达菌株

将靶标基因插入含有T7启动子的表达型载体，将含靶标基因的表达载体转化至RNase III缺陷型大肠杆菌HT115(DE3)，获得高表达dsRNA的表达菌株；

2)发酵培养