[发明专利]一种微生物源双链RNA的快速制备方法

权利要求书

1.一种微生物源双链RNA的快速制备方法，包括：

1)构建表达菌株

将靶标基因插入含有T7启动子的表达型载体，将含靶标基因的表达载体转化至RNaseIII缺陷型大肠杆菌HT115(DE3)，获得高表达dsRNA的表达菌株；

2)发酵培养

将经过活化的含有步骤1)表达菌株的菌液加入TB液体培养基中，摇床过夜培养，将菌液转接至新鲜的TB液体培养基，摇床培养至OD1.0-1.5后加入2.0-3.0mM IPTG诱导剂，诱导发酵17-22h后结束发酵；其中，所述TB液体培养基中均含有氨苄青霉素和四环素；

3)快速提取

发酵结束后离心获得重组菌细胞，将其悬浮于含有NaCl的TE缓冲液中，其中NaCl浓度为0.5-1.0M，pH 7.5-8.5，物理方式破碎细胞，通过60-80℃加热40-60min后，10000-12000rpm离心15-20min，获得dsRNA生物制剂。

2.根据权利要求1所述的微生物源双链RNA的快速制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的靶标基因为具有黄瓜花叶病毒CMV防治作用的靶标基因。

3.根据权利要求1所述的微生物源双链RNA的快速制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述物理机械设备为超声波细胞破碎仪、高压匀浆机或高速珠磨机。

4.根据权利要求3所述的微生物源双链RNA的快速制备方法，其特征在于，利用超声破碎仪完全破碎细胞时，将破碎细胞置于冰上，破碎方式为：破碎1s停2-3s，共20min。

5.根据权利要求3所述的微生物源双链RNA的快速制备方法，其特征在于，利用高压匀浆机完全破碎细胞时，将破碎细胞于冰上放置10-30min后进行破碎，匀浆压力为60-80MPa，匀浆次数为1-2次。

6.根据权利要求1所述的微生物源双链RNA的快速制备方法，其特征在于，所述含有T7启动子的表达型载体为pGEM-T easy载体。

7.根据权利要求1所述的微生物源双链RNA的快速制备方法，其特征在于，还包括dsRNA的定量步骤，具体为：

取上清液，加入等体积酚氯仿溶液抽提蛋白，离心后取上清，加入等体积异丙醇沉淀，离心、弃上清，沉淀用RNase-Free H₂O溶解；用DNase I特异性消化DNA，用RNase A消化单链RNA，加入LiCl溶液后于-20℃沉淀1-2h去除上清，沉淀用乙醇洗涤，再加入RNase-Free H₂O溶解，最后用超微量分光光度计测定dsRNA的含量。

8.根据权利要求7所述的微生物源双链RNA的快速制备方法，其特征在于，在定量步骤中，RNase A消化单链RNA时盐浓度大于0.3M，LiCl溶液浓度为2.5-3.0M。