[发明专利]一种基于黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A双特异性单克隆抗体的免疫亲和柱及其应用

说明书

本发明公开了一种基于黄曲霉毒素B₁和赭曲霉毒素A双特异性单克隆抗体的免疫亲和柱及其应用。具体公开了一种抗黄曲霉毒素B₁(AFB₁)和赭曲霉毒素A(OTA)的双特异性单克隆抗体的制备方法，获得稳定分泌同时识别AFB₁和OTA的抗体的杂交瘤细胞，并将制备得到的双特异性单克隆抗体应用于制备免疫亲和柱中，该亲和柱只需偶联一种抗体即可同时提取AFB₁和OTA两种对象，且偶联率易调节和测算，两种对象的结合位点数量相等、结构均一、干扰少；本发明的免疫亲和柱与ELISA联用，具有简便快速、特异性强、灵敏度较高的特点，在检测、监控食品农产品中的AFB₁和OTA多残留有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种基于黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A双特异性单克隆抗体的免疫亲和柱及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁,AFB₁)和赭曲霉毒素(ochratoxin A,OTA)是谷类中常见的霉菌毒素污染物。AFB₁被国际癌症研究机构归为一级致癌物，OTA则被归为2B类致癌物。由于AFB₁和OTA都是谷类产品的必检项目，而且二者常同时污染谷物类食品，因此提供同时检测两者的快速简便的检测方法是十分有必要的。免疫分析法具有特异、灵敏、简便、快速的优点，近年来成为研究的热点。目前，国内外已有关于AFB₁和OTA免疫检测的研究报道，但这些研究所用到的检测单元均为单特异性抗体，每种抗体只能识别一种目标抗原(如AFB₁或OTA)。双特异性单克隆抗体是一种结构上单价、功能上双价的抗体，其两个Fab功能区能分别结合两种不同的抗原(如AFB₁和OTA)，且该抗体结构保留了天然的免疫球蛋白结构，生物活性较高且稳定。双特异性单克隆抗体常通过杂交-杂交瘤技术制备得到。研究制备同时具有AFB₁和OTA特异性结合位点的双特异性单克隆抗体，并应用于多残留免疫检测，可以提高检测效率、简化操作、节约成本，具有明显优势，在食品中真菌毒素的快速检测中具有较好的应用前景。

免疫亲和柱(Immunoaffinity column，IAC)是目前最高效的纯化技术之一，其原理是以抗原抗体的特异性结合反应和固相萃取技术作为基础，将抗体固定在层析柱上，使样品中的待测物(抗原)与抗体进行特异性结合而被吸附，然后进行洗脱，使抗原解离。该技术可从复杂基质中提取抗原，达到同时净化和富集的效果，洗脱下来的抗原可用液相色谱法或者免疫分析法等进行定量分析。与常规固相萃取法相比，IAC是一种简便、快捷、高特异性的前处理方法，在提取样品时能避免有毒有机溶剂的过多接触，减少对实验人员健康的损害，且能有效减少基质中的杂质干扰，降低背景值，增加检测结果的可靠性，尤其适用于AFB₁和OTA等毒性大且样品中含量低的生物毒素。

现有的IAC均基于单特异性抗体制备，每种抗体只能吸附和提取一种待测物。食品中的生物毒素常存在两种或两种以上同时污染的现象，样品前处理时需要分别使用两种或以上IAC，操作复杂耗时且成本高。也有研究同时将两种抗体固定在IAC上，可实现两种对象的同时提取，但该方法原料抗体成本高，且两种抗体各自的偶联率和偶联比难以测算，纯化过程中也可能存在相互干扰。

发明内容

本发明的目的是为了克服传统IAC检测多种生物毒素时操作复杂耗时且成本高的问题，提供一种抗黄曲霉毒素B₁(AFB₁)和赭曲霉毒素A(OTA)的双特异性单克隆抗体的制备方法，以及一种基于该双特异性单克隆抗体的免疫亲和柱。

本发明的第一个目的是提供一种抗黄曲霉毒素B₁和赭曲霉毒素A的双特异性单克隆抗体的制备方法。

本发明的第二个目的是提供所述制备方法制备得到的抗黄曲霉毒素B₁和赭曲霉毒素A的双特异性单克隆抗体。