[发明专利]一种基于黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A双特异性单克隆抗体的免疫亲和柱及其应用

权利要求书

1.一种抗黄曲霉毒素B₁和赭曲霉毒素A的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(MNNG)将分泌抗AFB₁抗体的杂交瘤细胞诱导成HGPRT缺陷型细胞株，用甲基磺酸甲酯(MMS)将分泌抗OTA抗体的杂交瘤细胞诱导成TK缺陷型细胞株；

或者：用N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(MNNG)将分泌抗OTA抗体的杂交瘤细胞诱导成HGPRT缺陷型细胞株，用甲基磺酸甲酯(MMS)将分泌抗AFB₁抗体的杂交瘤细胞诱导成TK缺陷型细胞株；

S2.将步骤S1中的两种缺陷型细胞株进行细胞融合，经选择性培养基处理得到杂交-杂交瘤细胞；

S3.利用S2所述杂交-杂交瘤细胞分泌制备出能同时识别黄曲霉毒素B₁和赭曲霉毒素A的双特异性单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述诱导的方法包括：取分泌抗AFB₁抗体的杂交瘤细胞接种于含有HAT培养液中培养，再加入含5～20μg/mL N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(MNNG)的完全培养液中培养6～10h，经6-TG进行筛选后获得HGPRT缺陷型细胞株；取分泌抗OTA抗体的杂交瘤细胞接种于含有HAT培养液中培养，再加入含1～10μg/mL甲基磺酸甲酯(MMS)的完全培养液中培养4～6h，经5-BrdU进行筛选后获得TK缺陷型细胞株。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将在含N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(MNNG)的完全培养液中培养后的细胞接种至含有40～50μg/mL 6-TG的培养液中进行筛选；将在含甲基磺酸甲酯(MMS)的完全培养液中培养后的细胞接种至含有20～40μg/mL 5-BrdU的培养液中进行筛选。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述两种缺陷型细胞株进行细胞融合的比例为1:1，所述细胞融合的缺陷型细胞数量各为1×10⁶～1×10⁸个，所述选择性培养基为HAT培养基。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述双特异性单克隆抗体采用体内诱生法或体外培养法制得，所述双特异性单克隆抗体用辛酸硫酸铵法或Protein G纯化。

6.权利要求1～5任一所述制备方法制备得到的抗黄曲霉毒素B₁和赭曲霉毒素A的双特异性单克隆抗体。

7.权利要求6所述双特异性单克隆抗体在检测黄曲霉毒素B₁和/或赭曲霉毒素A中的应用。

8.一种基于双特异性单克隆抗体的免疫亲和柱，其特征在于，利用权利要求6所述双特异性单克隆抗体与CNBr-Sepharose 4B干粉进行偶联，再用封阻液进行封闭，装柱后制得所述免疫亲和柱。

9.根据权利要求8所述的免疫亲和柱，其特征在于，所述双特异性单克隆抗体与CNBr-Sepharose B4干粉的偶联量比例为(1：100)～(1：20)，所述偶联液为0.08～0.12mol/L PBS或0.08～0.12mol/L CBS缓冲液，偶联时间为0.8～1h，所述封阻液为pH为6～10的0.01～0.5mol/L Tris-HCl溶液。

10.权利要求8或9所述免疫亲和柱在纯化和/或富集待检样品中黄曲霉毒素B₁和/或赭曲霉毒素A中的应用。