[发明专利]病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法及试剂盒，本发明两步扩增的方法，第一步扩增使用上游长引物池进行单端扩增；第二步扩增在反应体系中加入下游长引物池，还有引物P1和引物P2，一共三种引物组成第二步扩增的引物，随后进行质控、纯化、高通量测序和数据分析。本发明首次使用两步法多重扩增配合二代测序的方法在人呼吸道肺泡灌洗液样本和血液或血浆样本中检测到传统临床方法中鉴定不出的病原微生物，灵敏度高，检出极限是每毫升50个病原基因组拷贝，快速简单，测序数据量少，降低了检测的成本。

技术领域

本发明涉及感染性疾病临床检测技术领域，特别涉及一种病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法及试剂盒。

背景技术

能够感染人的病原微生物种类很多，绝大多数是病毒、细菌、真菌、寄生虫、支原体、衣原体等，它们广泛存在于人体中。通过呼吸道进行感染是最常见的一种方式，且具有很高的病死率。根据世界卫生组织（WHO）2018年公布的2016年统计数据，全球前十位死亡原因中下呼吸道感染高居第四位，在传染性疾病中位列第一，共导致约300万人死亡。

感染病原的筛查主要依靠分离培养法及自动化的微生物鉴定系统，虽然具有操作简便、成本低等优点，但也存在通量低、耗时长、分离过程易受主观因素影响等缺陷，整个过程通常包括病原体培养、鉴定和抗菌药物敏感性试验，需要2~4天甚至更长时间。环介导等温扩增是一种基于有链置换活性的DNA聚合酶的等温快速核酸扩增方法，已经应用于病原体检测，具有灵敏度高、特异性强、反应速度快、不需要特殊仪器等优点，但是该方法对引物的设计有特殊要求，因此在多重PCR及通量检测方面存在一定的缺陷。微流控技术具有小型化、集成化与自动化的优势，且试剂用量少、能耗低、污染少，但该方法技术成本高，不利于临床大规模的病原微生物筛查及在中小医院推广。除此以外还有荧光qPCR和免疫荧光法等临床常用病原检测手段，这些方法虽然都是临床广泛认可，但存在通量低，应用病谱窄等缺陷。传统的病原微生物临床诊断认为的金标准依然是培养法，但培养阳性率差异非常大，比如血液培养的阳性率只有10%。

近几年随着二代测序技术的成熟和临床应用，基于Illumina Nextseq550测序平台的宏基因组二代测序法（mNGS）也逐渐被临床接受并用于多个系统感染疾病检测，包括上下呼吸道感染、血液感染或脓毒症、感染性脑炎或脑膜炎、胸腹腔、骨关节、口腔等感染。mNGS方法是一种对样本核酸进行二代测序检测的技术，属于无差别的检测，因此对病原检测种类覆盖很广泛，可以用于检测真菌、细菌、病毒、寄生虫等，该技术对于新发或罕见的感染有较强的检测能力，2019年底的全球爆发的新冠病毒就是最先通过mNGS技术检测出来的。虽然mNGS技术拥有众多优点，但也有几个缺陷和硬伤：1.灵敏度低，由于受到测序法本身的限制mNGS检测灵敏度一直饱受诟病，虽然检测的种类很多，对于拷贝数低的病原比如胞内菌和RNA病毒等会出现漏检情况发生。2.宿主影响，mNGS是临床样本所有核酸的检测，因此大量的人源宿主核酸对方法干扰影响较大，需要使用去宿主技术对人源核酸进行去除，但往往去除宿主的同时也会对病原核酸产生影响，最终影响检出准确性。3.操作时间长且繁琐，mNGS宏基因组测序前需要对样本进行破壁、提取、去宿主、打断、末端修复、接头连接，以及多次纯化等操作环节的处理才能上机测序，不仅增加TAT周期，操作繁琐，而且每增加一个实验环节致病病原核酸就会损失一部分，最终直接影响检出率。4.成本高，mNGS需要基本20M reads的测序数据量才能保证检测结果准确性，所以测序成本占总成本比重较大，再加上前面提到的多个实验环节的成本。成本高也直接导致市场上的检测服务费用高，增加患者医疗支出，也影响技术的大规模普及和使用。因此目前需要开发出一种既兼顾检测病原种类或通量、又保证检测灵敏度高，而且快速简单、成本相对较低的病原微生物鉴定方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法及试剂盒。本发明两步扩增的方法，第一步扩增使用上游长引物池进行单端扩增；第二步扩增在反应体系中加入下游长引物池，还有接头序列P1和P2，一共三种引物组成第二步扩增的引物，随后进行质控、纯化、高通量测序和数据分析。