[发明专利]病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法及试剂盒

权利要求书

1.一种病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：引物池制作；

将所需要鉴定的多种病原特异的上游长引物和下游长引物分别按照等摩尔比例进行混合，得到上游长引物池和下游长引物池；所述上游长引物的结构依次为：接头序列P1、index序列、测序引物1、靶向病原序列上游扩增引物；所述下游长引物的结构依次为：接头序列P2、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物；所述接头序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示，所述接头序列P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示；

S2：两步法扩增；

（1）第一步扩增使用所述上游长引物池进行单端扩增；

（2）第二步扩增在所述步骤（1）的反应体系中加入所述下游长引物池，还有引物P1和引物P2，所述引物P1和所述引物P2的核苷酸序列分别与所述接头序列P1和所述接头序列P2相同，作为独立的引物形式存在；一共三种引物组成第二步扩增的引物；

S3：质控；

两步法扩增后的产物进行电泳检测；

S4：纯化；

两次扩增后的产物用磁珠进行纯化，得到纯化的测序文库；纯化后的测序文库进行精确定量和片段大小分析；

S5：测序；

按照测序平台要求稀释文库，以所述步骤S4定量的结果为标准并根据数据量需要进行混样，采用Illumina Miniseq SE150进行测序；

S6：数据分析；

对测序原始数据进行过滤、合并，然后进行数据库比对，确定病原的种属区分和定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1步骤之前还包括收集临床样本、样本前处理和核酸提取的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上游长引物的总长度为80~90 bp，所述index序列长度为8~10 bp。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下游长引物的总长度为90~100 bp，所述分子标签UMI序列由8~15个随机碱基组成，所述linker序列的长度为2~5bp。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二步扩增后的产物的长度为100~150 bp。

6.一种引物池，其特征在于，所述引物池包括上游长引物和下游长引物；

所述上游长引物的结构依次为：接头序列P1、index序列、测序引物1、靶向病原序列上游扩增引物，所述上游长引物的总长度为80~90 bp，所述index序列长度为8~10 bp；所述接头序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示；

所述下游长引物的结构依次为：接头序列P2、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物，所述下游长引物的总长度为90~100 bp，所述分子标签UMI序列由8~15个随机碱基组成，所述linker序列的长度为2~5 bp；所述接头序列P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。

7.根据权利要求6所述的引物池，其特征在于，所述上游长引物的结构还可以依次为：接头序列P1、index序列、测序引物1、index序列、靶向病原序列上游扩增引物，所述上游长引物的总长度为80~90 bp，所述index序列长度为8~10 bp；所述接头序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。

8.根据权利要求6所述的引物池，其特征在于，所述下游长引物的结构还可以依次为：接头序列P2、分子标签UMI序列、linker序列、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物，所述下游长引物的总长度为90~100 bp，所述分子标签UMI序列由8~15个随机碱基组成，所述linker序列的长度为2~5bp；所述接头序列P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。

9.一种病原微生物检测试剂盒，其特征在于，包括如下成份：

DNA聚合酶、dNTP、上游长引物混合物、下游长引物混合物、引物P1、引物P2、水；所述上游长引物的结构依次为：接头序列P1、index序列、测序引物1、靶向病原序列上游扩增引物；所述下游长引物的结构依次为：接头序列P2、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物；所述引物P1和所述引物P2的核苷酸序列分别与所述接头序列P1和所述接头序列P2相同，作为独立的引物形式存在；所述上游长引物混合物包括SEQ IDNO.1~40的40条引物，所述下游长引物混合物包括SEQ ID NO.41~80的40条引物，所述引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示，所述引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。