[发明专利]一种膜蛋白的纯化方法

说明书

本发明公开了一种膜蛋白的纯化方法，包括：诱导目的膜蛋白在宿主细胞中表达；破碎宿主细胞，490g～1000g低速离心后取上清，将上清于30000g高速离心后取沉淀；用缓冲液重悬上述沉淀，然后加入去垢剂，震荡溶解后离心，取上清；采用亲和层析纯化，使用包含缓冲液、无机盐、十二烷基‑β‑D‑麦芽糖苷、咪唑和甘油的洗脱液进行洗脱，洗脱液超滤离心后即得目的膜蛋白。本发明针对现有的膜蛋白纯化方法存在去垢剂导致膜蛋白变性，目标膜蛋白提取率低，操作复杂，成本高昂等技术问题，将低速离心和高速离心结合，并对去垢剂进行选择，有效提高了总蛋白中目的膜蛋白的含量，即本发明提供了一种操作简单、成本低廉、提取率高且适用性广泛的膜蛋白纯化方法。

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种膜蛋白的纯化方法。

背景技术

膜蛋白是生物膜功能的主要承担者，表达量相对较低，通常是作为蛋白-脂类-去垢剂的复合物来进行纯化的。这个复合物在水环境中的溶解度允许采用与水溶性蛋白质本质上相同的分离技术，区别在于：进行膜蛋白纯化时需要在溶液中加入去垢剂，蛋白质-去垢剂复合物是动态的，在自由去垢剂分子不存在的情况下，去垢剂分子会立即解离下来。带有6个组氨酸标签的水溶性蛋白可参照标准流程直接进行纯化，但带有6个组氨酸标签的膜蛋白与固定金属离子亲和色谱(IMAC)结合较弱，使得纯化效果相比水溶性蛋白差，可能是由于去垢剂与蛋白的结合限制了组氨酸标签与IMAC配体之间接触。

去垢剂可分为离子型、非离子型和两性去垢剂。离子型去垢剂包括SDS、N-月桂基肌氨酸、CTAB和胆酸钠，能从膜中有效地提取蛋白，这些去垢剂苛刻，倾向于将蛋白变性，因为它们会破坏分子内和分子间蛋白之间的相互作用。非离子型去垢剂包括麦芽糖苷、葡萄糖苷和聚氧乙烯二醇，这类去垢剂用于膜蛋白的纯化和结构研究。两性去垢剂包括Zwittergents、Fos-Cholines、CHAPS/CHAPSO和胺氧化物，这些去垢剂像非离子型去垢剂一样是电中性的，但通常能像离子型去垢剂一样破坏蛋白之间相互作用，因此温和程度介于中间。

发明内容

本发明针对现有的膜蛋白纯化方法存在目标膜蛋白提取率低，操作复杂，成本高昂等技术问题，提供了一种膜蛋白的纯化方法，通过将低速离心和高速离心结合，并对去垢剂进行筛选，有效提高了总蛋白中目的膜蛋白的含量，改善了膜蛋白纯化过程的可操作性和高成本，即本发明提供了一种操作简单、成本低廉、提取率高的膜蛋白纯化方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种膜蛋白的纯化方法，所述方法包括：

步骤1、诱导目的膜蛋白在宿主细胞中表达；

步骤2、破碎宿主细胞，490g～1000g低速离心后取上清，将上清于30000g高速离心后取沉淀；

步骤3、用重悬缓冲液重悬步骤2所得沉淀，然后加入去垢剂，震荡溶解后离心，取上清；

步骤4、将步骤3所得上清采用亲和层析纯化，使用包含十二烷基-β-D-麦芽糖苷、咪唑和甘油的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，超滤离心后即得目的膜蛋白。

进一步的，步骤1中，所述目的膜蛋白选自：内皮素受体B蛋白、鼠疫耶尔森菌毒力蛋白、B淋巴细胞抗原中的任意一种。

进一步的，步骤1中，所述宿主细胞为原核细胞和/或真核细胞。

进一步的，步骤2中，当宿主细胞为原核细胞时，于4℃，490g低速离心15min后取上清；当宿主细胞为真核细胞时，于4℃，1000g低速离心15min后取上清。

进一步的，步骤3中，所述去垢剂选自：体积比1：0.1的十二烷基-β-D-麦芽糖苷和胆固醇半琥珀酸三盐；或体积比1：0.2的1-十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1′rac甘油)和胆固醇半琥珀酸三盐；或体积比1：0.2的正十二烷基磷酸胆碱和胆固醇半琥珀酸三盐。