[发明专利]一种在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒及其构建方法

说明书

本发明公开了一种在大肠杆菌内稳定遗传的酵母‑大肠杆菌穿梭质粒及其构建方法。所述的穿梭质粒是基于细菌‑酵母人工染色体，从pGEN‑MCS质粒上通过PCR扩增得到hok‑sok和par元件，然后通过连接将稳定遗传元件hok‑sok和parA构建入细菌‑酵母人工染色体中，进而获得方便克隆长片段DNA、无抗性且在大肠杆菌内稳定遗传的酵母‑大肠杆菌穿梭质粒。优选的，所述的穿梭质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的穿梭质粒载体，不但可实现酵母、细菌内穿梭，可在酵母中通过同源重组进行多片段DNA组装，还可以稳定的在大肠杆菌中复制、遗传，便于进行DNA提取。

技术领域

本发明涉及穿梭质粒及其构建方法，特别涉及一种在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒及其构建方法。本发明属于生物技术领域。

背景技术

随着我国的经济水平逐渐提高，居民的物质生活水平也在不断改善，对肉类的消费水平也逐年增加。所以，近年来，我国畜牧养殖业的发展十分迅速。但是，伴随畜牧养殖业动物种类与数量的增加，动物疫病的发生、发展情况也令人担忧，形成新的挑战，比如，最近的非洲猪瘟疫情，猪链球菌病以及布鲁氏菌病。疫苗是防控动物疫苗的有效方法之一。其中，活载体疫苗与基因工程亚单位疫苗是常见的疫苗制备方法。大肠杆菌是最常见的活载体及蛋白抗原表达宿主，对其质粒载体的开发，对于疫苗的制备至关重要。

在构建多价苗或联苗时，需要将多个抗原通过合理的方式进行串联，以实现蛋白表达。而某些抗原是受多基因或基因簇控制的。这就需要合适的载体，既能实现多片段、大规模的组装(比如，几十上百kb)，又能稳定的在活载体大肠杆菌中进行复制与遗传。目前所用的方法是使用细菌-酵母人工染色体(pCC1BAC-YAC)，可以使用转化介导的重组克隆方法在酵母体内进行多片段、大规模的组装，这种方法是将具有同源末端的基因组DNA片段和线性化的载体共同转染到酵母中，利用酵母细胞中高效的重组系统，使载体与基因组DNA的同源序列间进行重组，即可产生带有目的DNA片段的酵母人工染色体(YACs)克隆。但是这种质粒载体在大肠杆菌内可稳定遗传的代数有限。而活载体疫苗往往在动物体内需要停留很长时间，在没有抗生素作为选择标记的情况下，质粒容易丢失。

hok-sok是毒素-抗毒素系统，最早被发现在大肠杆菌的抗药性质粒R1上。hok编码具有强毒性的跨膜蛋白，可以造成膜结构不可逆的损伤。sok由一小段特定的反义RNA顺式编码，可以阻断hok蛋白的表达。在含有质粒的细胞中，sokRNA与激活的hokmRNA结合，从而阻断hokmRNA与核糖体的结合，抑制hok蛋白的表达；而在无质粒的细胞中，由于sokRNA很快被降解，hokmRNA半衰期长，相应的毒性蛋白得以充分表达且不断聚集，最终导致细胞死亡。parA也编码于pR1，结构类似于着丝粒，是负责细菌在分裂时质粒分离的系统。它常与hok-sok共同出现于质粒pR1上，因此，两者不存在相容性的问题。

本发明基于细菌-酵母人工染色体pCC1BAC-YAC，从pGEN-MCS质粒上通过PCR扩增得到hok-sok和par元件，通过连接，将hok-sok和par元件构建入pCC1BAC-YAC，得到质粒pCC1-sok/par。体外传代后，利用抗性与PCR验证，证明pCC1-sok/par经67次划线传代后，仍然能稳定的遗传。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可稳定遗传的穿梭质粒载体，以解决上述的技术问题。本发明的另一个目的在于提供上述穿梭质粒载体的构建方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒，所述的穿梭质粒是基于细菌-酵母人工染色体，从pGEN-MCS质粒上通过PCR扩增得到hok-sok和par元件，然后通过连接将稳定遗传元件hok-sok和par构建入细菌-酵母人工染色体中，进而获得方便克隆长片段DNA、无抗性且在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒。