[发明专利]一种在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒及其构建方法

权利要求书

1.一种在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒，其特征在于，所述的穿梭质粒是基于细菌-酵母人工染色体，从pGEN-MCS质粒上通过PCR扩增得到hok-sok和par元件，然后通过连接将稳定遗传元件hok-sok和par构建入细菌-酵母人工染色体中，进而获得方便克隆长片段DNA、无抗性且在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒。

2.如权利要求1所述的在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒，其特征在于，所述的细菌-酵母人工染色体为pCC1BAC-YAC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.如权利要求2所述的在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒，其特征在于，所述的穿梭质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1-3任一项所述的在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以pGEN-MCS为模板，设计引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：

SOK/PAR-F：

AAGGATCCGGCGTAATCATGACAACATCAGCAAGGAGAAAG

SOK/PAR-R：

ACACAGGAAACAGCTATGACCAGCATGAAGAGTTTCAGAAAATG

利用上述引物SOK/PAR-F、SOK/PAR-R进行PCR扩增得到SOK/PAR片段；

(2)以pCC1BAC-YAC为模板，设计引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：

pCC1 SOK/PAR-F：GTCATAGCTGTTTCCTGTGTG

pCC1 SOK/PAR-R：CATGATTACGCCGGATCCT

利用上述引物pCC1 SOK/PAR-F、pCC1 SOK/PAR-R进行PCR扩增得到pCC1BAC-YAC载体片段；

(3)对步骤(1)和(2)所得的PCR产物进行电泳观察和割胶回收纯化，得到备用的pCC1BAC-YAC载体片段和带有同源臂的SOK/PAR片段；

(4)连接步骤(3)所得的载体片段和SOK/PAR片段；

(5)将步骤(4)所得连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞中；

(6)挑取单菌落接种于含氯霉素的LB液体培养基，摇床培养，提取以获得重组质粒DNA，鉴定正确的重组质粒即为在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中以pGEN-MCS为模板，进行PCR扩增得到SOK/PAR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中以pCC1BAC-YAC为模板，进行PCR扩增得到pCC1BAC-YAC载体片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌EPI300感受态细胞。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的转化的具体步骤为：电压2500V电击一次，加入800uL LB液体培养基重悬并于37℃复苏60min，4000rpm离心3min，100μL上清重悬沉淀，将转化子混合物涂布于浓度为25μg/mL的氯霉素的LB固体培养基上，培养过夜。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(6)中以重组质粒DNA为模板，设计引物并通过PCR扩增以验证片段的插入，所述引物的核苷酸序列如下所示：

pCC1-seq-F：ACTGGGCACAACAGACAATC

pCC1-seq-R：GCTCAGCGGTGGCAGCAG。

10.权利要求1-3任一项所述的在大肠杆菌内稳定遗传的酵母-大肠杆菌穿梭质粒的应用，其特征在于，所述的穿梭质粒不但可以在酵母、细菌内穿梭，在酵母中通过同源重组构建质粒，还可以在细菌中以低拷贝或多拷贝稳定的复制、分离。