[发明专利]一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法

说明书

本发明涉及一种基于LC‑MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，所述壳寡糖包括壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖，所述检测分析方法包括以下步骤：(a)取生物样品进行前处理，得到样品滤液，后进行LC‑MS分析，得到样品LC‑MS信号；(b)称取壳寡糖标准物并分别将其配成标准储备液，再将标准储备液用水逐级稀释，配制一系列浓度的标准溶液，之后与空白试剂混合进行LC‑MS分析，得到标准曲线；(c)根据步骤(b)得到的标准曲线对步骤(a)得到的样品LC‑MS信号进行分析，得到生物样品中壳寡糖的含量。与现有技术相比，本发明具有简单快速、检测限低、检测灵敏度高和重复性好的优点，用于生物样本中壳寡糖含量的测定，能够满足生物样本中目标物的检测要求。

技术领域

本发明属于食品及生物检测领域，具体涉及一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法。

背景技术

壳寡糖(chitooligosaccharide，COS)是壳聚糖的降解产物，是由2-10个N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖是自然界中唯一的阳离子糖类，安全无毒，功能作用广，具有降低体重、降胆固醇、免疫调节、抗肿瘤、抑制腐败菌、调节胃肠道等功能。壳寡糖分子量小，易溶于水，可被人体、动物及植物机体吸收，具有良好的生理活性。

壳寡糖由于自身没有紫外吸收基团，又无发色基团，导致其定量检测困难，尤其在生物样品中易受到生物源成分干扰，使得微量检测更为困难。目前对壳寡糖的定量检测方法主要有高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-安培法、毛细管电泳法、荧光光度法等。

壳寡糖的分离检测技术一直是研究者的关注点之一，尽管壳寡糖分析方法多种多样，但改进现有方法，使其具有更好的专属性与灵敏度一直是研究的热点和难点问题。在壳寡糖的液相分离中，由于壳寡糖自身含有氨基和羟基两种官能团，一方面自身极性很强，难以直接在反相C18柱上得到良好的保留，另一方面紫外吸收弱，难以在紫外检测器上得到高灵敏响应。为改善壳寡糖的保留与检测问题，通常使用氨基柱进行分离，采用示差折光法检测器进行检测，但是氨基柱的使用寿命不长，示差折光法的灵敏度不高且不适合应用梯度洗脱分离样品，很难实现在复杂体系中实现壳寡糖的快速、微量检测。

专利CN109884209A公开了一种保健品中壳寡糖(聚合度DP＝2～7)的高效液相色谱串联质谱的检测方法，其中包括步骤：(1)制备标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱检测，得到不同浓度的混合标准溶液谱图；(2)将步骤(1)所得的标准谱图按壳寡糖不同聚合度(DP＝2～7)分别制作浓度与色谱峰面积关系曲线图；(3)壳寡糖样品的预处理及高效液相色谱串联质谱检测；(4)样品中壳寡糖含量的确定，将步骤(3)中获得的样品谱图的保留时间确定壳寡糖聚合度并与步骤(2)中得到的标准曲线比对，用外标法确定壳寡糖的含量。该方法壳二糖检测的线性范围为0.5-20ug/mL，壳三糖的线性范围为0.5-20ug/mL，壳四糖的线性范围为0.5-20ug/mL；本方法中壳二糖的检测定量范围为0.002-2.56ug/mL，壳三糖的线性范围为0.02-5.12ug/mL，壳四糖的线性范围为0.2-25.6ug/mL，定量下限低于该方法，表明本方法的灵敏度更高。该方法仅适用于保健品中壳寡糖的测定，本方法能够在复杂生物体系中对壳寡糖进行测定，通过样品前处理消除生物样品中内源性物质的干扰，实现在复杂生物体系中的微量检测。

发明内容

本发明的目的就是提供一种基于LC-MS对生物样品中壳寡糖的检测分析方法，可用于具有不同聚合度的壳寡糖的含量测定，也可用于具有单一聚合度的壳寡糖的含量测定。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，所述壳寡糖包括壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖，壳二糖的分子量：341.1545，壳三糖的分子量502.2243，壳四糖的分子量663.2931，壳五糖的分子量为824.3619，所述检测分析方法包括以下步骤：