[发明专利]一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法

权利要求书

1.一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，其特征在于，所述壳寡糖包括壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖，所述检测分析方法包括以下步骤：

(a)取生物样品进行前处理，得到样品滤液，后进行LC-MS分析，得到样品LC-MS信号；

(b)称取壳寡糖标准物并分别将其配成标准储备液，再将标准储备液用水逐级稀释，配制一系列浓度的标准溶液，之后与空白试剂混合，按照生物样品前处理的操作进行处理，随后进行LC-MS分析，得到标准曲线；

(c)根据步骤(b)得到的标准曲线对步骤(a)得到的样品LC-MS信号进行分析，得到生物样品中壳寡糖的含量。

2.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，其特征在于，步骤(a)和步骤(b)中，LC-MS分析所采用的条件参数为：

所述色谱条件为：流动相A为含氨水的水，流动相B为含氨水的乙腈；洗脱采用梯度洗脱或者等比例洗脱；

所述质谱条件为：采用电喷雾电离离子源进行电离，正离子靶向选择离子扫描模式进行扫描。

3.根据权利要求2所述的一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，其特征在于，步骤(a)和步骤(b)中，LC-MS分析所采用的条件参数为：

所述色谱条件为：

色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide，型号为2.1×100mm，1.7um，柱温为45℃，进样量为2uL，流速为0.2mL/min，流动相A为含0.1％(v/v)氨水的水，流动相B为含0.1％(v/v)氨水的乙腈，采用梯度洗脱时，洗脱梯度为：

所述质谱条件为：

采用正离子模式，靶向-选择离子扫描，扫描参数为：壳二糖：340.1545～342.1545，壳三糖：501.2233～503.2233，壳四糖：662.2931～664.2931，壳五糖：823.3619～825.3619；分辨率为70000，鞘气流速为40arb，混合气流速为10arb，混合气加热温度为350℃，离子源温度为320℃，正离子喷雾电压为3.5kV，S-lens RF为电压50V，离子源和碰撞气都为高纯氮气。

4.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，其特征在于，步骤(a)中，所述生物样品包括液体样本和固体样本，所述液体样本包括血清、血浆、血液、体液、组织匀浆和尿液，所述固体样本包括粪便、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾、胰腺、大脑、小脑和肠道内容物。

5.根据权利要求4所述的一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，其特征在于，当生物样品为液体样本时，样品前处理过程具体为：在液体样本中加入甲醇-乙腈溶剂，涡旋混匀后静置，之后离心取上清液，上清液经过滤后得到样品滤液，后装入带内插管的液相小瓶中进行LC-MS分析。

6.根据权利要求5所述的一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，其特征在于，液体样本和甲醇-乙腈溶剂的体积比为1∶1～1∶5，甲醇-乙腈溶剂中，甲醇和乙腈的体积比为1∶3～3∶1，涡旋的转速为2500～3200rpm，涡旋的时间为30～90s，静置的温度为-20℃，静置的时间为10～30min，离心的温度为4℃，离心的转速为12000～15000rpm，离心的时间为5～15min，过滤采用0.22um的滤膜。

7.根据权利要求4所述的一种基于LC-MS的生物样品中壳寡糖的高灵敏度检测分析方法，其特征在于，当生物样品为固体样品时，样品前处理过程具体为：先将固体样本和水混合进行研磨，之后依次进行第一次涡旋、第一次静置、超声、第二次静置和第一次离心，得到一号上清液，取一号上清液并加入甲醇-乙腈溶剂，第二次涡旋混匀后进行第三次静置，之后第二次离心得到二号上清液，取二号上清液经过滤后得到样品滤液，后装入带内插管的液相小瓶中进行LC-MS分析。