[发明专利]一种分蘖洋葱遗传转化体系建立方法

说明书

本发明属于植物基因工程领域，特别提供了一种农杆菌介导的分蘖洋葱遗传转化方法，包括如下步骤：制备转化受体、制备侵染液、侵染、共生培养、筛选、丛生芽分化、生根培养，得到带有Hyg^R抗性基因的分蘖洋葱遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得分蘖洋葱转基因植株。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种以分蘖洋葱茎尖诱导的愈伤组织为受体的转基因方法。

背景技术

分蘖洋葱(Allium cepa L.var.multiplcans Bailey syn.var.Agrogatum Don)为百合科(Liliaceae)葱属(Allium)一年生草本植物，又名毛葱、珠葱、分蘖葱头等，体细胞染色体数2n＝16。分蘖洋葱适应性强，高产、耐贮，供应期长，可调剂蔬菜淡季供应，是公认的良好前茬作物。此外，分蘖洋葱适合与其他农作物间作、套作，提高复种指数，减少农药使用，有利于发展绿色农业。

洋葱种质按形态特征可分为：普通洋葱(Allium cepa L.)，种子繁殖；分蘖洋葱，分蘖小鳞茎繁殖；顶球洋葱(Allium cepa L.var.viviparum Metz.)，气生鳞茎繁殖。以洋葱栽培品种‘HG40OB’的鳞茎盘胚性愈伤组织为受体，利用基因枪介导法，成功获得转水稻锌指蛋白基因OSISAP1洋葱[徐启江,崔成日.用基因枪法介导OSISAP1基因遗传转化洋葱.植物生理与分子生物学学报,2007,33(3):188-196.]。Eady等人通过农杆菌转化洋葱愈伤组织，PCR和Southern Blot检测获得催泪因子合成酶(Lachrymatory Factor Synthase)lfs基因沉默植株，即“无泪”洋葱[Eady CC,Weld RJ,Lister CE.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation and transgenic-plant regeneration ofonion(Allium cepa L.).Plant cell reports,2000,19(4):376-381；Eady CC,Kamoi T,Kato M,et al.Silencing onion lachrymatory factor synthase causes asignificantchange in the sulfur secondary metabolite profile.Plant physiology,2008,147(4):2096-2106.]。但有关分蘖洋葱遗传转化体系的研究还未见报道，因此有必要建立一种获得高阳性率的分蘖洋葱遗传转化方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种操作简便、重复性及转化效率高的分蘖洋葱遗传转化方法。

一种分蘖洋葱遗传转化体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分蘖洋葱外植体的获取及愈伤组织诱导

1.1)获取分蘖洋葱无菌外植体：将分蘖洋葱剥去鳞茎外皮，切除顶部2/3，同时去除根部，流水冲洗20～40min，于超净工作台上，75v/v％乙醇消毒30～60s后用2v/v％次氯酸钠浸泡10～16min，期间摇荡数次，无菌水清洗3～5次，无菌滤纸吸干，剥取中心1～2mm茎尖或鳞茎盘；

1.2)愈伤组织诱导：将步骤1.1)获取的茎尖或鳞茎盘接种于愈伤组织诱导培养基中，22～24℃暗培养2～3w，每隔15d继代一次；所述的愈伤组织诱导培养基配方是在MS培养基的基础上还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，pH＝5.8；

2)农杆菌的制备与活化

2.1)菌种活化：将pCAMBIA1300-AcCHS超表达载体转化至农杆菌LBA4404中；

2.2)菌种鉴定：以Hyg^R-FP、Hyg^R-RP为引物，菌液PCR检测鉴定阳性农杆菌；