[发明专利]一种分蘖洋葱遗传转化体系建立方法

权利要求书

1.一种分蘖洋葱遗传转化体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分蘖洋葱外植体的获取及愈伤组织诱导

1.1)获取分蘖洋葱无菌外植体：将分蘖洋葱剥去鳞茎外皮，切除顶部2/3，同时去除根部，流水冲洗20～40min，于超净工作台上，75v/v％乙醇消毒30～60s后用2v/v％次氯酸钠浸泡10～16min，期间摇荡数次，无菌水清洗3～5次，无菌滤纸吸干，剥取中心1～2mm茎尖或鳞茎盘；

1.2)愈伤组织诱导：将步骤1.1)获取的茎尖或鳞茎盘接种于愈伤组织诱导培养基中，22～24℃暗培养，每隔15d继代一次；所述的愈伤组织诱导培养基配方是在MS培养基的基础上还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，pH＝5.8；

2)农杆菌的制备与活化

2.1)菌种活化：将pCAMBIA1300-AcCHS超表达载体转化至农杆菌LBA4404中；

2.2)菌种鉴定：以Hyg^R-FP、Hyg^R-RP为引物，菌液PCR检测鉴定阳性农杆菌；

2.3)侵染液准备：取1mL摇好的菌液加入至100mL YEB培养基，28℃，180rpm振荡培养至菌液的OD₆₀₀为0.8～1.0；菌液4000rpm离心15min，弃上清，加100mL MS基本培养基重悬农杆菌，调整OD₆₀₀为0.6～0.8，侵染液制备完成；侵染液28℃，80rpm摇菌2～4h诱导vir基因表达；所述YEB培养基含50mg/L卡那霉素、25mg/L链霉素、25mg/L利福平，所述MS基本培养基含200mg/L乙酰丁香酮；

3)遗传转化与共生培养

3.1)侵染：选取经过1～2次继代培养的致密、嫩黄分蘖洋葱愈伤组织，放入步骤2.3)制备好的侵染液中，28℃，50rpm侵染1～4h；

3.2)共生培养：将侵染过的愈伤组织用滤纸擦干，转至共生培养基中，暗培养3～4d后，无菌水冲洗3次，再用50mg/L头孢霉素浸洗30～60s；所述共生培养基配方是在MS培养基的基础上还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂、100mg/L乙酰丁香酮，pH＝5.8；

3.3)筛选培养：将愈伤组织转移至筛选培养基，每隔15d继代一次，筛选培养2～4w；所述筛选培养基配方是在MS培养基的基础上还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂、50mg/L潮霉素、50mg/L头孢霉素，pH＝5.8；

4)愈伤组织丛生芽分化筛选

4.1)丛生芽分化：将存活的愈伤组织转移至丛生芽分化筛选培养基1，2～3w后继代于丛生芽分化筛选培养基2；所述丛生芽分化筛选培养基1配方是在MS培养基的基础上还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂、3.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、50mg/L潮霉素、50mg/L头孢霉素，pH＝5.8，所述丛生芽分化筛选培养基2配方是在MS培养基的基础上还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂、1.0mg/L6-苄氨基嘌呤、1.0mg/L萘乙酸、50mg/L潮霉素、50mg/L头孢霉素，pH＝5.8；

5)生根及驯化移栽

5.1)生根：将丛生芽接种于生根培养基，2～3w开始生根，所述生根培养基配方是在1/2MS培养基的基础上还包括30g/L蔗糖、8g/L琼脂、50mg/L潮霉素、50mg/L头孢霉素，pH＝5.8；

5.2)驯化移栽：生根培养待试管苗长至8～10cm，根长4～5cm，打开封口膜，加入适量水保湿，在室温下散光炼苗2～3d；将分蘖洋葱植株取出后，清水冲净根部附着的培养基，移栽到灭菌营养土中。

2.根据权利要求1所述的一种分蘖洋葱遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤1.2)、步骤3.2)、步骤3.3)、步骤4.1)、步骤5.1)、步骤5.2)的培养温度为22～24℃，步骤3.3)、步骤4.1)、步骤5.1)、步骤5.2)培养条件为光强2000Lux，光照时间12～14h。