[发明专利]微生物发酵法制备D-丙氨酸的方法

说明书

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵法制备D‑丙氨酸的方法。本发明首先构建一株生产D‑丙氨酸的基因工程菌，所述工程菌以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，通过敲除丙氨酸消旋酶基因alr和L‑丙氨酸转氨酶alaT；过表达meso‑二氨基庚二酸脱氢酶编码基因；敲除iolR阻遏蛋白基因同时基因组整合表达葡萄糖激酶基因glk1；整合来自大肠杆菌的edd和eda基因获得。该菌株以葡萄糖为底物直接发酵法生产D‑型氨基酸，成本低，技术简单，5L发酵罐中D‑丙氨酸产量能够达到50‑60g/L。另外，发酵法高效合成D‑型氨基酸属于开创性研究，借此方法，可以对发酵法进行无限扩展，低成本、高效率合成多种D‑型氨基酸。

技术领域：

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵法制备D-丙氨酸及其他D-型氨基酸的方法。

背景技术：

天然蛋白质的基本手性单元均为L-型氨基酸，一般认为D-型氨基酸在自然界中极少存在，但是随着分析方法的发展，人们相继在多种生物体内发现了D-型氨基酸。以微生物为例，目前发现了20余种D-型氨基酸，它们存在于细胞壁的肽聚糖、多肽抗菌素和麦角碱等成分中。

由于D-型氨基酸在生化性质方面具有自身显著的特性，已被广泛应用于合成抗生素和生理活性肽，并在食品、农药、化妆品、尤其是医药方面发挥着越来越重要的作用。D-型氨基酸及其衍生物是合成抗菌、抗病毒药物、杀虫剂的重要中间体。D-型氨基酸为NRPS合成多肽类次级代谢物的重要原料，包括多种多肽类抗生素。D-型氨基酸还可以用于食品调味剂、营养添加剂、甜味剂、保鲜剂、防腐剂、食品发色剂、食品香料等产品。D-丙氨酸具有可预防肾结石、协助葡萄糖代谢，缓和低血糖等生理功能。用作营养增补剂，可有效调节营养平衡。D-丙氨酸是维生素B6的原料，也是合成二肽甜味剂L-天冬氨酸-D-丙氨酸的原料。L-天冬氨酸-D-丙氨酸的甜度是蔗糖的2000倍，阿斯巴甜的10倍。多种D-型氨基酸具有甜味，如D-缬氨酸、D-苯丙氨酸和D-色氨酸的甜度也远远超过蔗糖。作为一种重要的手性源，D-丙氨酸可用作手性药物、手性添加剂、手性助剂等，广泛应用于制药及食品行业。D-谷氨酸能够加速康复、延缓皱纹形成和皮肤衰老。由于脑组织中含有D-谷氨酸，其可能参与视觉、听觉和镇痛过程。聚谷氨酸能够以L-谷氨酸或D-谷氨酸作为合成单体。D-苯丙氨酸和D-对羟基苯甘氨酸是生产治疗缺铁性心脏病、心力衰竭和糖尿病药物的重要原料，如果作为β-内酰胺类抗生素的组成部分，则难以被细菌降解，不至于产生抗药性。D-脯氨酸是一种抗艾滋病病毒蛋白酶抑制剂的原料之一。多种D-型氨基酸具有抑制细菌生物膜形成的作用，D-丝氨酸可作为神经递质，D-天冬氨酸可以增加胶原含量和提高皮肤细胞抗氧化作用。D-丝氨酸和D-天冬氨酸具有潜在的药用价值，D-型氨基酸可以用来开发新型人工半合成抗生素。

D-型氨基酸的制备方法有化学合成法、物理拆分法和生物合成法。化学合成法主要通过化学的方法直接合成D-型氨基酸，但是过程复杂、产物纯度低，不利于大规模生产。对映体拆分法主要通过色谱柱、离子交换树脂等方法对D，L-氨基酸进行拆分，但是成本高、产量低，不适合大规模生产。