[发明专利]一种共表达NFAT和人DNAM-1蛋白的重组质粒、重组细胞及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种共表达NFAT和人DNAM‑1蛋白的重组质粒、重组细胞及其构建方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供了所述重组质粒的构建方法和构建得到的重组质粒，并以所述重组质粒为基础构建得到重组细胞和单克隆重组细胞。本发明所述重组质粒双向启动子启动DNAM‑1基因与NFAT‑Luciferase基因的表达，基因表达时互不影响。本发明所述重组细胞基于人免疫类型细胞Jurkat所构建，与NK细胞模型更相近，且在构建所述重组细胞时，不会引入病毒，也不会导致细胞发生炎症相关通路，操作简单。利用本发明所述重组细胞或单克隆重组细胞还可以检测和/或筛选抗人DNAM‑1抗体。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种共表达NFAT和人DNAM-1蛋白的重组质粒、重组细胞及其构建方法和应用。

背景技术

DNAM-1(DNAX accessory moleculule-1，CD226，NK细胞的活化型受体之一)最初被称为T细胞谱系特异性活化抗原(TLISA1)，参与调节细胞毒性T细胞(CTL)的分化。随后发现其在血小板上亦有表达，并且可以参与血小板的活化与聚集，遂更名为血小板T细胞活化抗原(PTA1)，进一步研究发现NK细胞表面亦有表达，2000年国际白细胞分化抗原会议上被正式命名为DNAM-1，具有多个Ig样结构域的蛋白，能与MHC-I(主要组织相容性复合体)分子结合。现已证实，DNAM-1能正向调节NK细胞的活化和增殖，通常表达在肿瘤组织浸润的NK细胞表面，是NK细胞激活的标志。通过增强DNAM-1的功能可以改善人体在病毒感染或自身免疫疾病以及恶性肿瘤所带来的免疫系统的功能紊乱，改善疾病的预后。由于DNAM-1正向调节NK细胞的活性，增强NK细胞表面的DNAM-1分子功能可以增强NK细胞的抗肿瘤能力。抗人DNAM-1抗体通过特异性结合DNAM-1分子来提高DNAM-1的功能，达到增强NK细胞的抗肿瘤效力，从而最大化动员患者自身的免疫系统反应杀伤肿瘤细胞达到治疗肿瘤的目的，因此以DNAM-1为靶点的免疫治疗性药物的开发以及DNAM-1的激活具有重要价值。

既往测定DNAM-1激活的方法主要为：使用相关调控抗体CD155的方法来进行治疗性抗体的研发，但这种方法由于CD155为竞争型受体，既能与CD226蛋白结合而激活NK细胞，又能与TIGIT蛋白结合而抑制NK细胞的功能，并不能得到激活DNAM-1分子抗体。因此现有技术迫切需要一种能够直接识别结合DNAM-1蛋白的抗体的检测方法，从而筛选到抗DNAM-1抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种共表达NFAT和人DNAM-1蛋白的重组质粒、重组细胞及其构建方法和应用，所述重组质粒、重组细胞能够双向启动子启动DNAM-1基因与NFAT-Luciferase基因的表达，且基因表达时互不影响，能够直接识别并结合DNAM-1蛋白抗体，从而筛选到抗DNAM-1抗体。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种共表达NFAT和人DNAM-1蛋白的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：(1)将NFAT-reverse的编码基因序列插入到载体PB-713B-1的SpeI和BstBI酶切位点之间，进行无内毒素质粒的小提制备，得PB-NFAT-Luc-713质粒；

(2)对人DNAM-1的基因序列进行密码子优化后，插入到所述PB-NFAT-Luc-713质粒的Bsu36I和NdeI酶切位点之间，进行无内毒素质粒的大提制备，得到重组质粒PB-NFAT-Luc-CD226。

优选的，步骤(1)所述NFAT-reverse的编码基因序列的5'端包括SpeI酶切位点和Luc序列，3'端包括BstBI酶切位点。

优选的，步骤(2)经所述密码子优化后的人DNAM-1的基因序列，5'端包括Bsu36I酶切位点和LTR序列，3'端包括NdeI酶切位点。

优选的，所述密码子优化后的人DNAM-1的基因序列如SEQ ID NO.2所示。