[发明专利]一种全禽源H5N2亚型禽流感重组毒株、疫苗及其应用

权利要求书

1.一种全禽源H5N2亚型禽流感重组病毒，其特征在于，由高致病性H5N6亚型禽流感流行毒株改造后的HA基因与H5N2亚型禽流感病毒D7株的七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS构成；所述改造后的HA基因序列如SEQ ID NO：9所示；所述D7株的七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～3、5～8所示；所述H5N6亚型禽流感流行毒株为A/Duck/Guangdong/19123/2019。

2.权利要求1所述全禽源H5N2亚型禽流感重组病毒的制备方法，其特征在于，将高致病性H5N6亚型禽流感流行毒株改造后的HA基因与H5N2亚型禽流感病毒D7株的七个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS一起拯救出重组病毒，即得。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述方法包括构建分别表达H5N2亚型禽流感病毒D7株PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的7个质粒，构建表达SEQ ID NO：9所述序列的改造后HA基因的质粒，将上述8种质粒混合，并与转染试剂一起加入到293T细胞中，拯救获得H5N2亚型禽流感重组病毒。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

S1.构建H5N2亚型禽流感病毒D7株的八质粒反向遗传操作系统，所述八质粒为分别包含H5N2亚型禽流感D7株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS 8个基因片段的重组质粒；所述D7株的八个基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～8所示；

S2.构建表达SEQ ID NO：9所述序列的改造后HA基因的质粒；

S3.将步骤S1中表达H5N2亚型禽流感病毒D7株PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的7个质粒与步骤S2中表达改造后HA基因的质粒混合，并与转染试剂一起加入到293T细胞中，培养后获得H5N2亚型禽流感重组病毒。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述重组质粒为pSMC-PB2、pSMC-PB1、pSMC-PA、pSMC-HA、pSMC-NP、pSMC-NA、pSMC-M和pSMC-NS。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述pSMC载体的构建方法为将pCI载体质粒上的BsmBI酶切位点去除，得到pCI-NEW，通过基因合成的方式得到转录启动子序列、终止子序列以及转录元件；最后将载体pCI-NEW及获得的转录元件分别用XhoI、MluI双酶切后连接转化，所获得的重组质粒经过酶切鉴定和测序鉴定为阳性的质粒即为pSMC。

7.一种基于反向遗传技术的重组全禽源H5N2亚型禽流感疫苗候选株，其特征在于，包括免疫量的权利要求1所述全禽源H5N2亚型禽流感重组病毒。

8.权利要求1所述全禽源H5N2亚型禽流感重组病毒、或权利要求7所述重组全禽源H5N2亚型禽流感疫苗候选株在制备预防H5N6亚型禽流感疫苗中的应用。