[发明专利]高产维生素B2

说明书

本发明公开了高产维生素B₂枯草芽孢杆菌工程菌株、其构建方法和应用。具体是在枯草芽孢杆菌中引入rib操纵子非翻译区突变；引入核黄素激酶ribC（G596A）；引入腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA（P242L）引入核酮糖‑5‑磷酸‑差向异构酶突变基因rpe（A504del）；无痕敲除rpe；单独或组合无痕敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG、nupG。所构建的核黄素生产菌株相比野生型产量有大幅提高，因而具有较大的推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及生产维生素B₂的基因工程菌株菌株，其基因工程构建方法，以及其在制备维生素B₂中的应用。

背景技术

维生素B₂又名核黄素，是一种水溶性维生素，其分子式为C₁₇H₂₀O₆N₄，IUPAC中文名：7,8-二甲基-10-（1’-D-核糖醇基）-异咯嗪。核黄素在细胞中经过连续的两步反应生成黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），它们可以作为黄素蛋白的辅酶或辅基参与细胞内呼吸电子传递与多种还原反应。许多微生物可以从头合成核黄素，而包括人在内的哺乳动物不能自身合成只能从食物中获取。核黄素缺乏会引起多种疾病，如发育迟缓、视力下降、口唇炎症等。因为其重要的生理作用，核黄素被广泛应用于保健品、食品以及畜牧业中。核黄素的生产方法主要为微生物发酵法，包括阿舒颊囊酵母（Eremothecium ashbyii）、棉囊阿舒氏酵母（Ashbya gossypii）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产氨棒杆菌（Corynebactia aminogensis）在内的微生物都可以作为核黄素的生产菌株。而枯草芽孢杆菌由于其生长速度快、培养条件简单、核黄素产率高等优势而逐渐成为了微生物发酵生产核黄素的主要菌株。

核黄素的生物合成途径从葡萄糖出发，经过戊糖磷酸途径、嘌呤合成途径、核黄素合成途径最终生成核黄素。核黄素合成中所需的ATP则经由糖酵解途径和TCA循环提供，而核黄素合成的两个前体核酮糖-5-磷酸和鸟苷三磷酸分别由戊糖磷酸途径和嘌呤合成途径产生。最终核酮糖-5-磷酸和鸟苷三磷酸在核黄素操纵子编码的4个酶的催化下，经过7步反应生成核黄素。

核黄素操纵子的转录强度受到核糖开关的调节，通过突变核糖开关序列可以解除细胞对核黄素操纵子的表达调控。腺嘌呤琥珀酸合成酶（PurA）催化次黄嘌呤核苷酸转变为腺苷琥珀酸。通过突变purA基因可以削弱该反应对次黄嘌呤核苷酸的分流，增加鸟苷三磷酸的合成。核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶（ribulose 5-phosphate 3-epimerase，Rpe）是核酮糖-5-磷酸与木糖-5-磷酸相互转变的关键酶，也在连接糖酵解途径与戊糖磷酸途径中起着重要作用。在数据库中，Rpe是一个双向的酶，且没有文献报道说明哪个方向是更强的。而之前的文献更倾向通过过表达该酶增加从糖酵解途径向戊糖磷酸途径的通量，并没有文献尝试过敲除或降低该酶活性来提高核黄素前体合成。然而我们推测该酶倾向催化从核酮糖-5-磷酸生成木糖-5-磷酸的反应，即核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶突变会减少核酮糖-5-磷酸生成木糖-5-磷酸，从而降低戊糖磷酸途径流向糖酵解途径的流量，使核黄素代谢通路流量增加。鸟苷三磷酸合成途径中的嘌呤中间体会对嘌呤合成途径产生抑制。通过敲除菌株的嘌呤转运蛋白，可以使细胞内嘌呤类物质的浓度降低，解除反馈抑制，增加鸟苷三磷酸的合成，进而提高核黄素的产量。