[发明专利]一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法。本发明提供一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法，包括：乳清中加入硫酸铵的步骤。本发明从牛奶中提取细胞外囊泡的方法，具有如下优点：首次验证硫酸铵可以用于mEVs的沉淀，且重新溶解后mEVs仍具有活性；该方法能够提高mEVs的产量，纯度相当，且成本更低，可以用于大规模生产mEVs；未来mEVs可以作为天然的纳米载体，递送蛋白质、药物及功能性RNA等生物活性分子，调节细胞的功能，治疗疾病，具有很大的临床转化前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由细胞主动向外分泌的具有双层膜结构和生物活性的纳米球状物质，主要由脂质、蛋白质和遗传物质组成。其主要类型包括：外泌体(exosomes，粒径30-150nm)、微囊泡(microvesicles，粒径100-1000nm)、凋亡小体(apoptotic bodies，粒径1000nm)。EVs的特点是分子结构小，生物相容性高，可用于运输脂质、蛋白质、DNA及RNA等物质，是天然的内源性纳米载体。EVs广泛存在于生物体内，包括植物，哺乳动物和人。原则上，所有的活细胞都会分泌EVs。目前主要从细胞培养基以及血液、尿液、脑脊髓液、乳汁、羊水和腹水等体液中提取EVs。EVs在细胞间的信息传递中起重要作用，参与体内多种生理和病理过程，包括炎症、组织稳态、神经元沟通、免疫系统调节、肿瘤发生与转移等。EVs具有多样化的功能和广泛临床应用前景，可用于疾病诊断、纳米药物递送、靶向治疗、免疫治疗等。作为递送药物和功能性RNA的有效载体，EVs具有明显的优势：广阔而天然的来源、纳米尺寸、含有可用于靶向治疗的膜配体。目前临床转化EVs有很多困境，具体如下：产量问题，目前的大多数方法获取的EVs产量较低，比如超速离心法；纯度问题，许多方法会分离出和EVs大小类似的生物分子，造成潜在的污染；来源问题，尽管EVs来源广泛，但是获取同质性更高的EVs比较困难；规模效益问题，在较低成本下获取大量的EVs是临床转化的一个关键点。

牛奶来源的细胞外囊泡(bovine milk-derived extracellular vesicles，mEVs)在纳米载体方面具有众多优势。首先，牛奶作为日常饮食的一部分，天然的来源对人体具有较好的生物相容性，降低了临床中出现免疫反应的可能性。与细胞疗法相比，mEVs更易储存且安全性较高。其次，牛奶比细胞培养基更容易获得且更有成本效益，能够大规模生产，是纳米药物递送的理想选择。mEVs递送药物可以提高药物的稳定性，体内循环周期长，具有药物代谢动力学的优势。mEVs的磷脂双分子膜具有膜蛋白和靶向配体，比如CD47、CD63、组织相容性复合物Ⅰ/Ⅰ类分子等。更重要的是，mEVs可以保护内容物免受胃肠道中酸性物质和消化酶的侵害，这意味着口服mEVs是合理可行的。

目前，分离EVs的主流方法包括，超速离心法、尺寸排阻法、超滤法、免疫捕获法、聚合物沉淀、以及非对称流场流分离法等。其中，超速离心法所需仪器昂贵，回收率低，会分离出粒径类似的杂质，对EVs有潜在的损害。尺寸排阻法一种将溶液中的分子按其大小(在某些情况下为分子量)分开的色谱法，但是产量及效率较低，不适宜大规模生产。超滤法可以根据粒径或分子量大小快速分离EVs，但是纳米孔径的超滤膜可能影响最终的EVs提取效率。免疫捕获法利用特异性抗体识别EVs表面的标志物来分离EVs，特异性高，但是价格昂贵且不适合处理大体积样本，而且容易丢失抗原表达偏低的EVs。聚合物沉淀法产量高，但是产物中存在大量蛋白质杂质，所需时间较长。非对称流场流分离法是基于层流效应的分离方法，主要缺点是可重复性差，效率低。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的分离EVs产量低、效率低、成本高缺陷，从而提供一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法。

一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法，包括：乳清中加入硫酸铵的步骤。

可选的，乳清中加入硫酸铵所得溶液中硫酸铵饱和度为2％-90％；