[发明专利]一种葡萄糖异构酶、突变体及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种葡萄糖异构酶及其突变体，以及其编码基因，以及其在微生物催化D‑葡萄糖异构化制备高果糖浆F‑55中的应用。本发明提供的高效表达耐高温葡萄糖异构酶的重组大肠杆菌，解决了一般的耐高温葡萄糖异构酶生产高果糖浆F‑55反应温度过高的问题；应用该菌种生产葡萄糖异构酶具有产量高、工艺简单、周期短、便于工业化应用等优点，该菌株可直接用于高果糖浆F‑55的生产，而不需要细胞破碎；发酵培养结束后在80℃条件下对D‑葡萄糖的总酶活达到606.8U/g，D‑葡萄糖的转化率达到67.3％，80℃下保温24h残余酶活为75％，反应平衡时间为2.5h，这为高果糖浆F‑55的工业化大规模生产提供了良好的技术支持。

(一)技术领域

本发明涉及一种葡萄糖异构酶及其突变体，以及其编码基因，以及其在微生物催化D-葡萄糖异构化制备高果糖浆F-55中的应用。

(二)背景技术

葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，GI，EC 5.3.1.5)，又称木糖异构酶(Xyloseisomerase，XI)，在体内可以将D-木糖异构化生成D-木酮糖，可以将腐烂的植物体降解为腐生菌可以吸收的糖类，此外，还可以用于半纤维素的生物转化制备燃料乙醇。在体外葡萄糖异构酶主要用将D-葡萄糖异构化生成D-果糖，是生物酶法制备高果糖浆的关键酶，也是工业上最重要的酶之一。

高果糖浆(HFCS)是D-葡萄糖和D-果糖的混合物，也称果葡糖浆，是一种天然的甜味剂，也是一种新发展起来的淀粉糖产品。HFCS比蔗糖具有更好的稳定性和溶解度、更高的甜度和更低的价格等优势逐渐取代蔗糖，成为主流的甜味剂，已经广泛应用于食品与医药等行业，尤其是在软饮料行业深受消费者喜爱。HFCS根据果糖含量可分为三类：F-42，F-55和F-90。F-90主要是通过F-42分离、浓缩、纯化制得，基本不直接作为添加剂使用，一般用于制备F-55。F-55一般是由F-90与F-42混合制成。自从上世纪六十年代作为一种甜味剂问世以来，高果糖浆的应用领域不断扩大导致其市场需求逐年增加。目前制备高果糖浆的主要方法为化学法和生物酶法。其中葡萄糖异构酶生物转化生产F-42依旧是市场上高果糖浆的主要来源。

葡萄糖异构酶使D-葡萄糖异构化为D-果糖是一个热力学平衡反应。葡萄糖异构酶(第一类GI)一般在高于60℃左右时，催化活性降低，转化率最高达42％-45％，因此只能用来制备F-42。而耐高温葡萄糖异构酶(第二类GI)，可将反应温度提高至80℃以上，促进D-葡萄糖向D-果糖转化，从而将转化率提高提高到55％以上，直接生产F-55。

目前已经有许多的耐高温葡萄糖异构酶报道，例如来自放线菌(Actinomycetechainia sp.NCIM 2960)的葡萄糖异构酶最适反应温度60℃；来自Caldicoprobacteralgeriensis的葡萄糖异构酶最适反应温度为90℃，在100℃的半衰期为6min；来自Thermotoga maritima的葡萄糖异构酶最适反应温度为105-110℃，是目前报道的反应温度最高的葡萄糖异构酶，在120℃半衰期为10min，在80℃半衰期超过24h。目前比较成熟的是60-65℃的HFCS生产工艺，以嗜热菌为催化剂的大规模生产对设备要求高，且它们在高温下的热稳定性和重复使用性较差，因此通过基因工程技术构建酶活性好热稳定性好的基因工程菌在F-55的制备中具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种葡萄糖异构酶及其突变体和编码基因，以及其在催化D-葡萄糖异构化制备高果糖浆F-55型产品中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种葡萄糖异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述葡萄糖异构酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。