[发明专利]一种利拉鲁肽的固相合成方法

说明书

本发明涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法，将Fmoc‑Arg(NO₂)‑Gly‑OH连接到固相载体上，然后按照利拉鲁肽序列偶联其他氨基酸和片段以产生肽树脂，将肽树脂从树脂中切割出新型硝基保护的利拉鲁肽，其中精氨酸残基的两个胍基受硝基保护，在液相中合成了在C端含有OPfp酯的片段，并将其偶联到固相载体上，有效地减少了与产品性质高度相似的消旋杂质His¹的产生，并减少了类似的缺失杂质如Ala²、Gly⁴、Glu³，并通过在纯化步骤之前选择等电点沉淀策略来降低利拉鲁肽的生产成本。

技术领域

本发明涉及利拉鲁肽技术领域，尤其涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法。

背景技术

利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发，是一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，采用基因重组技术制备。专利US6268343B1和US6458924B2中描述了利拉鲁肽的固液相合成，其中需要反相HPLC纯化中间体GLP-1(7-37)-OH，然后与N^α-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu在液相条件下反应。在该工艺中，GLP-1(7-37)-OH的N端未受到保护，侧链的保护基团全部被去除，导致杂质大量产生，纯化困难，操作步骤复杂。这些工艺技术复杂，成本高，不适合大规模生产多肽。

专利W02018032521A1描述了采用二肽、三肽、四肽和五肽偶联策略合成利拉鲁肽，具有较好的产率和纯度。然而，在实际应用中，三肽和五肽片段在DMF、NMP或DMSO等偶联溶剂中的溶解度较低，且偶联效率会随着片段大小的增加而降低。

EP2757107描述了在赖氨酸位置使用Fmoc-Lys(Alloc)-OH合成利拉鲁肽。但这些方法工艺复杂，成本高，不适合大规模生产。Alloc的脱保护需要金属催化剂，如较为昂贵的Pd(PPh₃)₄。此外，催化剂对水分敏感，反应必须在受控条件下进行，最终产物中的重金属含量也是一个需要考虑的问题。因此，这个工艺在商业上是不可行的。

WO2016067271A1描述了利用四肽偶联策略合成利拉鲁肽，以及用于赖氨酸的Fmoc-Lys(Dde)-OH。然而，利用固相合成技术合成四肽及其在后续步骤中的应用是非常昂贵的。Dde基团的脱保护需要水合肼溶液，由于它具有氧化性，易引起多种副反应。

WO2018104922A1描述了通过氨基酸顺序偶联合成利拉鲁肽，以及用于赖氨酸的Fmoc-Lys(Mtt)-OH。然而Mtt基团的去除需要重复使用酸性试剂，这样会影响到主链上不耐酸的氨基酸保护基团和树脂，从而产生更多的杂质。

除此之外，在所有上述专利和固相多肽合成的一般技术中，都存在一些缺点，例如产生大量的废弃物，这意味着在全体脱保护中通过裂解液从树脂中分离多肽时，会产生不需要的固体物质。继而乙腈、硅胶和试剂的高消耗又增加了纯化成本。

利拉鲁肽的合成方法在现有技术中都存在缺陷。

当利拉鲁肽的合成通过逐步顺序氨基酸偶联进行时，会有更大的可能形成类似如des-Ala²、des-Gly⁴、des-Thr⁵和des-Thr⁷的缺失杂质，这反过来又增加了纯化成本，并且杂质去除也很繁琐。这是由于偶联效率随着肽链的增加而降低。

发明内容