[发明专利]一种利拉鲁肽的固相合成方法

权利要求书

1.一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

S1：在活化剂体系存在下，将N端Fmoc保护的二肽Fmoc-Arg(NO₂)-Gly-OH偶联到树脂固相载体上；

S2：在第一个二肽片段，即Fmoc-Arg(NO₂)-Gly-OH锚定后，使用含10％-30％的哌啶溶液来切割Fmoc基团；

S3：在切割Fmoc保护基团后，游离氨基与序列中的下一个氨基酸偶联；

S4：在第二个肽片段即Fmoc-Arg(NO₂)-Gly-OPfp偶联后，所连接的Fmoc基团被裂解；

S5：在所有氨基酸完成连接后，通过使用混合裂解液，从树脂中切割出肽链，反应在0-40℃下保持搅拌2-5小时，氨基酸按照以下序列进行偶联和裂解：Fmoc-Arg(NO₂)-Gly-OH，Fmoc-Arg(NO₂)-Gly-OPfp，Fmoc-Leu-Val-OPfp，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ile-Ala-OPfp，Fmoc-Glu(OtBu)-Phe-OPfp，Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OPfp，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-Ala-OPfp，Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp，Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-OPfp，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Val-OPfp，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OPfp，Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OPfp，Boc-His(Boc)-Ala-OPfp；

S6：用乙醚、二异丙基醚或甲基叔丁基醚处理TFA中的裂解肽链，并在5-10℃下放置1-2小时，使产品沉淀，将沉淀产物过滤并用乙醚洗涤3-5次并干燥；

S7：用氢氧化钠溶液或DIPEA或氨水将被硝基保护的利拉鲁肽粗品水溶液的pH调节至8.0-9.5，除去废弃物；

S8：过滤所得的反应物，并根据等电点，通过使用乙酸或高氯酸或三氟乙酸来调节上述水溶液的pH值至5.0-6.5；

S9：使用甲酸和钯碳从硝基保护的利拉鲁肽中脱去硝基；

S10：对上述利拉鲁肽粗品水溶液进行反相高效液相色谱纯化，并将所需纯组分冻干，得到99.4％的纯利拉鲁肽，其序列为NH₂-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg(NO₂)-Gly-Arg(NO₂)-Gly-COOH。

2.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：S1中所述固相载体包括王树脂、CTC树脂、PHB树脂、HMPA树脂、HMPB树脂、Rink acid树脂、TentaGel TGA树脂、TentaGel SPHB树脂。

3.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：S2中的哌啶溶液可以但不局限于是哌啶溶于DMF、DMSO、NMP或N,N-二乙基乙酰胺这些非质子溶剂，S3中所述氨基酸是溶于DMF、DMSO、N，N-二乙基乙酰胺或NMP的Fmoc-Arg(NO₂)-Gly-OPfp。

4.根据权利要求1或3所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：Fmoc保护的氨基酸和偶联试剂总是过量投入，投入量是树脂取代物的2-4倍当量。

5.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：S5中所述混合裂解液体积比TFA:TIS:PhOH:H₂O为92.5:2.5:2.5:2.5，用于从树脂中分离多肽。