[发明专利]一种怀地黄的脱毒方法

说明书

本发明涉及药用植物组培脱毒培养技术领域，具体涉及一种怀地黄的脱毒方法，包括如下步骤：切取感染病毒的地黄无菌苗的茎尖，在条件为：于体积分数为1％的TAE电泳缓冲液中，在5‑30mA电流条件下刺激处理1‑10min，再接种于培养基内培育，经脱毒检测后得脱毒怀地黄。本发明提供了一种快速、简单、经济有效的方法对怀地黄进行脱毒，为怀地黄脱毒种苗工厂化生产提供前期的技术支持，同时也为其他植物脱毒技术的研究提供一定的参考。

技术领域

本发明属于药用植物组培脱毒培养技术领域，具体涉及一种怀地黄的脱毒方法。

背景技术

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)是我国著名的“四大怀药”之一，长期营养繁殖致使其病毒感染严重，导致产量下降，品质退化。据调查，烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)常单一或混合感染河南焦作地区的地黄，从而引起地黄产量降低、种性退化和品质下降，严重影响了怀地黄的种植效益和临床用药，为提高怀地黄产量，改善其品质，并使其良种长期推广种植，生产健康无病毒的种苗是控制和防止这些病原体传播的主要途径。

传统的怀地黄无病毒培养主要采用茎尖培养或热处理结合茎尖培养，这也是目前解决怀地黄最常用的两种方法，但单纯茎尖培养的脱毒效率较低，仅为36％(李明军等，河南师范大学学报，2008)，而热处理又会对怀地黄植株造成一定程度的伤害，且仅热处理的时间就大约需要几周，脱毒时间较长，培养方法繁琐、生产成本高，不适合工业化生产。因此，如何尽快去除怀地黄的病毒，建立一种快速、简单、经济有效的方法来生产脱毒怀地黄种苗，已成为怀地黄脱毒苗生产中急需解决的一个重要问题。

发明内容

为了解决上述现有技术的问题，本发明提供了一种怀地黄的脱毒方法，本发明提供了一种快速、简单、经济有效的方法对怀地黄进行脱毒，为怀地黄脱毒种苗工厂化生产提供前期的技术支持，同时也为其他植物脱毒技术的研究提供了一定的参考。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种怀地黄的脱毒方法，包括如下步骤：

步骤1、茎尖剥离

无菌条件下，将感染病毒的地黄无菌苗剥去幼叶，切取带2个叶原基的茎尖；

步骤2、茎尖脱毒培养：

S1、茎尖电流刺激处理：

将步骤1切取的茎尖浸泡于无菌水中，然后进行弱电流刺激处理；

其中，弱电流刺激处理的条件为：于体积分数为1％的TAE电泳缓冲液中，在5-30mA电流条件下刺激处理1-10min，得电流刺激茎尖；

S2、茎尖培养：

将步骤S1的电流刺激茎尖接种于培养基内，并培育30-45d，经脱毒检测后得脱毒怀地黄。

优选的，所述电流刺激的条件为：于15mA电流条件下刺激处理1-10min。

优选的，所述电流刺激的条件为：于15mA电流条件下刺激处理5min。

优选的，所述叶原基茎尖的尺寸为0.3×(0.05-0.1)mm²。

优选的，所述步骤S2的培养基以MS液体培养基为溶剂，向其中加入0.5mg·L^-1的6-苄氨基嘌呤、0.1mg·L^-1萘乙酸、0.1mg·L^-1赤霉素、30g·L^-1蔗糖和6g·L^-1琼脂粉，混匀。

优选的，将所述培养基的pH值调至5.8-6.0，并于高温高压下灭菌20min。

优选的，所述高温高压的条件为121℃蒸汽灭菌。