[发明专利]一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种具有α‑葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，是先将待筛选的若干种中药材分别粉碎，再分别用有机溶剂提取，得若干上清液作为待测样本溶液；再在微孔板中加入反应体系；将空白对照样品和待测样本溶液一起置于酶标仪中震荡孵育，加入pNPG溶液摇匀测定各样品在400‑405nm处的吸光值；利用酶标仪自带软件记录吸光度值并绘制出空白对应样品及待测样品吸光度值变化曲线；得出样品曲线净面积Net AUC值；本发明方法一次可筛选几十种甚至上百种中药材，快速、准确率高，操作方便。

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法。

背景技术

现有研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以竞争性抑制小肠中的α-葡萄糖苷酶，阻断1，4-糖苷键水解，有效降低餐后血糖水平，市场上存在多种α-葡萄糖苷酶活性抑制药物，但是成本高且会产生不良反应。我国中草药资源丰富，且中医药治疗糖尿病历史悠久疗效显著，现有研究发现部分中药能有效抑制餐后血糖快速升高，如桑叶、升麻等。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法主要有对-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)法、葡萄糖氧化酶法和固定化酶法。其中较为常用的为pNPG法，该法操作方便简单，但目前该研究多采用终点法(测定反应某一时间点的结果作为最终评估结果)进行测定，反应过程不明朗，反应终点的选取对测定结果影响较大；同时测定样品数量有限，目前仍缺乏一种能够快速筛选并验证具有抑制α-葡萄糖苷酶活性物质的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于，提出一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，提高具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材筛选效率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有α-葡萄糖苷酶抑制功效的中药材的高通量筛选方法，包括以下步骤：

体外高通量筛选模型构建：建立α-葡萄糖苷酶和底物pNPG的体外反应模型，利用酶标仪检测生成物PNP的吸光值变化，进而反映中药材对酶的抑制活性；

药材库的建立：选取不同种类的中药材，粉碎后用不同浓度的有机试剂进行提取，获得提取液，建立药材库；

活性筛选：对药材库中的提取液进行过滤，取上清液稀释后加入反应模型使用酶标仪记录起吸光度并绘制曲线，将样品吸光度曲线与空白吸光度曲线进行对照，计算抑制效果。

优选的是，所述体外反应模型的反应底物组分为0.05-0.1mol/L、pH6.8-7.2的磷酸钠缓冲液50-150μL，0.8-1U/mLα-葡萄糖苷酶10～25μL，0.00193-0.00232mol/L pNPG溶液10-25μL。

优选的是，所述药材库建立步骤中，药材粉碎粒度为20-100目。

优选的是，所述药材库建立步骤中，分别用30％-90％浓度的乙醇溶液对药材进行提取，提取料液比为1:10-20，提取时间40-60min。

优选的是，所述活性筛选步骤中，使用酶标仪对生成物吸光度进行测定时，测定波长为400-405nm。

优选的是，所述活性筛选步骤中，每1min进行一次测定，持续90min。

优选的是，所述活性筛选步骤中，用空白吸光度曲线下面积(AUC_空白)减去样品作用曲线下的积分面积(AUC_样品)，得出曲线下净面积(Net AUC)，曲线下净面积(Net AUC)与空白曲线下面积的比值即为抑制率，计算公式为：

抑制率％＝(AUC_空白-AUC_样品)/AUC_空白×100。

优选的是，当抑制率为正数时证明该样品中具有抑制α-葡萄糖苷酶的能力，也说明该药材具有降血糖的功效；反之，抑制率为负数时，说明该样品不具备抑制α-葡萄糖苷酶的能力。