[发明专利]一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的基因工程菌及方法

说明书

本发明公开了基因工程领域的一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的基因工程菌及方法，包括所述蛋白基因prkacaa的克隆、重组表达载体pET‑28a‑prkacaa和基因工程菌的构建，基因工程菌诱导表达及目标蛋白表达形式分析，再通过镍离子亲和层析柱纯化获得目标蛋白。本发明提供的操作方法简便，成本低，重复性好，制备的目标蛋白可溶，纯度高，可应用于斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的功能研究，也为制备该蛋白的多克隆抗体奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种制备斑马鱼蛋白激酶A α催化亚基蛋白的基因工程菌以及制备斑马鱼蛋白激酶A α催化亚基蛋白的方法。

背景技术

蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，又称cAMP依赖的蛋白激酶A(cyclic-AMPdependent protein kinase A)是生物体内广泛存在的一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调控众多关键细胞活动，包括细胞代谢、基因表达和细胞增殖等。

不同生物中蛋白激酶A的催化亚基(catalytic subunit，PKAc)和调节亚基(regulatory subunit，PKAr)存在不同的亚型，人(Homo sapiens)的未活化的PKA是一种异四聚体全酶，由一个调节亚基二聚体与两个失活状态的催化亚基结合而成，催化亚基具有α，β，γ三种亚型，调节亚基具有Iα，Iβ，IIα，IIβ四种亚型，其中PKAα催化亚基在体内普遍存在，是最常见的一种催化亚基。

发明内容

本发明的目的通过对斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白基因的克隆、表达载体的构建、基因工程菌诱导表达目标蛋白以及目标蛋白的纯化，从而获得斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白。

一种含有斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白全长编码基因prkacaa的重组表达载体pET-28a-prkacaa，所述prkacaa序列为SEQ ID N0.1。

一种包含重组表达载体pET-28a-prkacaa的基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa。

一种由基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa诱导表达的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2。

一种由基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa诱导表达的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白作为抗原免疫动物研究的应用或作为潜在靶点进行环境毒理学效应分子机制研究。

一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，包括如下步骤：(1)斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白基因prkacaa的克隆，上游引物F(BamH I)为SEQ ID N0.3，下游引物R(Sal1)为SEQ ID NO.4；(2)重组表达载体pET-28a-prkacaa以及基因工程菌BL21(DE3) -pET-28a-prkacaa的构建，将所述prkacaa基因与表达载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a-prkacaa，转染BL21(DE3)感受态细胞，构建基因工程菌BL21(DE3) -pET-28a-prkacaa；(3)基因工程菌的诱导表达，将所述的基因工程菌株诱导培养；(4)斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的纯化，将诱导培养收集的菌体破碎，取上清液纯化。

优选的，所述的基因工程菌株用诱导剂IPTG诱导培养，诱导斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白表达的条件为37℃，180rpm条件下培养约2.5-3h至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5 mM的IPTG在25℃，180rpm下诱导6h。

优选的，所述菌体破碎取上清液的条件为以360w的功率冰浴超声破碎菌体，超3s，间隔3s，共超声20min，离心后沉淀重悬于PBS Buffer中，再次离心的上清液。