[发明专利]一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的基因工程菌及方法

权利要求书

1.一种含有斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白全长编码基因prkacaa的重组表达载体pET-28a-prkacaa，所述prkacaa序列为SEQ ID N0.1。

2.一种包含权利要求1所述的重组表达载体pET-28a-prkacaa的基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa。

3.一种由权利要求2所述的基因工程菌诱导表达的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0.2。

4.一种如权利要求3所述的斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，作为抗原免疫动物研究的应用或作为潜在靶点进行环境毒理学效应分子机制研究。

5.一种制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白基因prkacaa的克隆，上游引物F(BamH I)为SEQ ID N0.3，下游引物R(Sal1)为SEQ ID NO.4；(2)重组表达载体pET-28a-prkacaa以及基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa的构建，将所述prkacaa基因与表达载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a-prkacaa，转染BL21(DE3)感受态细胞，构建基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa；(3)基因工程菌的诱导表达，将所述的基因工程菌株诱导培养；(4)斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的纯化，将诱导培养收集的菌体破碎，取上清液纯化。

6.如权利要求5所述的制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，其特征在于所述的基因工程菌株用诱导剂IPTG诱导培养，诱导斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白表达的条件为37℃，180rpm条件下培养约2.5-3h至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG在25℃，180rpm下诱导6h。

7.如权利要求5所述的制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，其特征在于所述菌体破碎取上清液的条件为以360w的功率冰浴超声破碎菌体，超3s，间隔3s，共超声20min，离心后沉淀重悬于PBS Buffer中，再次离心的上清液。

8.如权利要求5所述的制备斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白的方法，其特征在于将上清液过柱纯化，过0.45μm滤膜的上清液负载到Ni²⁺亲和层析柱中室温摇床振荡1h以上，先用Equilibrium Buffer和WashBuffer冲洗柱子，再用Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即得到斑马鱼蛋白激酶Aα催化亚基蛋白，所述的EquilibriumBuffer组成为：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，pH 7.4；所述的Wash Buffer组成为：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，20-40mmol/L咪唑，pH 7.4；所述的Elution Buffer组成为：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，50-200mmol/L咪唑，pH 7.4。