[发明专利]特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用

说明书

本发明公开了特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用，属于生物医药领域。本发明还公开了一种基于CRISPR系统构建人AXL基因敲除细胞的方法。本发明所述的sgRNA可以介导Cas9蛋白高效地切割靶点DNA，进而用于编辑人AXL基因。本发明的sgRNA可以通过CRIPSR/Cas9系统实现高效打靶。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及特异性靶向人AXL基因的sgRNA及其应用。

背景技术

AXL一词源于希腊语“Anexelekto”，意为不受控制的，AXL与TYRO3、MER共同组成受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)中的TAM家族。AXL基因位于染色体19q13.2，共有20个外显子，编码一个含有894个氨基酸的蛋白分子。在结构上，AXL包含3个结构域：胞外结构域、跨膜域和胞内域。AXL的配体为生长停滞特异性蛋白6(growth arrestspecific protein 6，Gas6)。AXL的激活方式包括：配体依赖的激活和配体非依赖的激活。1988年，研究者在慢性髓性白血病患者向急性期转化的相关基因筛选中发现了AXL^[1]。1991年，两个课题组报道了AXL是一种具有转化潜力的受体酪氨酸酶，但它在细胞内的作用不清楚，其中一个研究组将其命名为UFO，意为未知功能的^[2,3]。1996年，AXL被证明能够影响成纤维细胞的有丝分裂和生存^[4]。近年来的研究发现AXL激活后能够活化下游多个信号通路，包括激活肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶C(PKC)等。AXL在肺腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等多种肿瘤组织中过表达，并参与调控肿瘤侵袭、转移和耐药等过程^[5,6]。以AXL为靶点开发小分子抑制剂和抗体是肿瘤治疗领域的热点之一。

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)被称为第三代人工核酸内切酶，可用于各种复杂基因组的编辑。由于其突变效率高、靶向精准、操作简单、周期短及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA--crRNA(CRISPRRNA)、tracrRNA(trans-activating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件。能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术。利用CRISPR系统进行针对AXL的基因编辑可以为肿瘤免疫治疗提供一种快速、简便、高效的策略。

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