[发明专利]一种鉴定稻水象甲特异引物对及其应用

说明书

本发明提供了一种用特异性PCR引物检测稻水象甲的方法。该方法是在RAPD技术获得稻水象甲序列基础上，设计出成对的、可用于快速鉴定该物种的特异性引物。利用该对引物建立PCR检测体系，扩增出370bp左右单一的、稻水象甲特有的DNA条带。该方法具有鉴定准确、操作方便、特异性好等优点，可实现对稻水象甲的快速分子鉴定，提高检测检疫工作的效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种稻水象甲特异引物及其快速鉴定方法。

背景技术

稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)，属鞘翅目(Coleoptera)、象虫科(Curculionidae)，原产于美国南部的德克萨斯州地区。该害虫在短短几十年间迅速在全球扩散蔓延，现已成为一种世界性的重要的水稻害虫，被国际自然保护联盟列为全球100种最具威胁性的外来入侵生物之一，也是全国植物检疫性害虫。稻水象甲于1988年首次在我国河北省唐山市唐海县发现，目前已有河北、天津、北京、辽宁、山东、浙江、吉林、安徽、湖南、山西、陕西、贵州、新疆等23个省(自治区、直辖市)报道该害虫的发生。稻水象甲主要为害水稻，成虫取食叶片，幼虫蛀食稻根，导致水稻减产。其还具有孤雌生殖、抗逆性强等特点，可迅速成为当地的优势种群，因此需要对其进行严格的检疫检测。

目前对稻水象甲的种类鉴定，主要依靠外部形态学特征进行。在我国绝大部分水稻田中经常出现近缘种，如稻象甲(Echinocnemus squameus Billberg)等。两者都营水生生活，成虫形态特征极为相似，在田间识别有一定的困难，需要昆虫分类专业人员和显微设备才能鉴别。而对于卵、幼虫、蛹等样本，形态学鉴定具有极大的难度，还需待其成虫后才能准确鉴定，不利于第一时间掌握该虫入侵的动态。这就需要新的快速鉴定方法的建立。

随着分子生物学的快速发展，分子鉴定方法有了长足的进步。该类方法不受环境、害虫样本及人为因素的影响，具有较高的特异性和准确性，将有助于检验检疫的快速开展。RAPD(randomamplified polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA技术，该方法通过人工合成的随机引物，对不同物种的DNA 的进行PCR(Polymerase Chain Reaction)，会可能得到不同的带谱。对于某一特定模板中出现的特异条带就可作为该模板的分子标记。RAPD技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。RAPD具有无需专门设计PCR扩增反应引物，无需知道被研究生物基因组的信息，易于得到PCR产物等优势，但也存在PCR产物不特异、结果不稳定、重复性差等缺点，给分子学鉴定带来一定的困难。目前还需要对鉴定方法进行进一步改进，实现稻水象甲快速和准确的分子鉴定。

发明内容

基于上述背景，本发明的目的为：提供一种稻水象甲特异引物对及快速鉴定方法，通过该特异性引物对可以实现稻水象甲的快速分子鉴定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成检测稻水象甲的特异性引物对。该特异性引物对是在RAPD技术获得稻水象甲序列基础上设计而来的。

本发明还提供了该特异性引物对在鉴定稻水象甲的应用，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以所述待测样品的DNA为模板，采用本发明提供的特异性引物对DNA模板进行PCR扩增；

(3)对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判定样品中DNA模板是否来源于稻水象甲；若电泳结果显示在370bp处有单一DNA条带，则该样品为稻水象甲；若未扩增出370bp 的序列片段，则样品为其它物种。