[发明专利]一种检测病原微生物的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，包括逆转录酶和Tn5转座酶；

所述逆转录酶为突变型逆转录酶，所述突变型逆转录酶的突变位点为：P55I、D204E、T334S、E566Q、D587N和L607I；

所述Tn5转座酶为突变型Tn5转座酶，所述突变型Tn5转座酶的突变位点为：K54E、I64Y、K160R、K200R和S303G。

2.根据权利要求1所述的检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述逆转录酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述Tn5转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Tn5转座酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，还包括逆转录反应液、Tn5转座酶反应液、引物、混合引物反应液、高保真扩增反应液和高保真扩增酶。

5.根据权利要求1所述的检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，还包括高保真扩增反应液，所述高保真扩增反应液包括0.1-5mmol/L的5-碘-2'-脱氧尿苷、0.05-10mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.01-0.05％的二甲基亚砜、0.005-0.01％的聚乙二醇和0.1-50mmol/L的柠檬酸二钠。

6.一种检测病原微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取样本的DNA和RNA，然后加入无核酸酶水进行孵育；

步骤2、在步骤1所得孵育后的核酸中加入逆转录酶，使RNA逆转录，然后加入Tn5转座酶进行片段化，片段化结束加入终止液停止片段化反应；

步骤3、对步骤2所得产物进行链置换、文库富集、文库纯化和质检后进行测序；

所述逆转录酶为突变型逆转录酶，所述突变型逆转录酶的突变位点为：P55I、D204E、T334S、E566Q、D587N和L607I；

所述Tn5转座酶为突变型Tn5转座酶，所述突变型Tn5转座酶的突变位点为：K54E、I64Y、K160R、K200R和S303G。

7.根据权利要求6所述的检测病原微生物的方法，其特征在于，所述链置换为：在步骤3所得产物中加入引物、高保真扩增反应液和高保真扩增酶进行链置换，替换RNA链。

8.根据权利要求6所述的检测病原微生物的方法，其特征在于，所述样本为血浆、脑脊液、骨髓液、房水、胸腹水、关节积液、组织、尿液、脓肿抽液、肺泡灌洗液、痰液或鼻咽拭子。

9.根据权利要求6所述的检测病原微生物的方法，其特征在于，所述步骤2中取1-5ng步骤1所得孵育后的核酸。