[发明专利]一种以太子参TuMV-phe病毒基因为基础修饰改造病毒表达载体的方法

说明书

本发明提供了一种以太子参TuMV‑phe病毒基因为基础修饰改造病毒表达载体的方法，利用太子参TuMV‑phe病毒基因组作为基础，将其改造成能够接收和携带外源基因的太子参病毒表达载体。将测试的指示性基因插入太子参特异TuMV‑phe载体，通过农杆菌介导方法侵染太子参和烟草，可以在2种植物体内快速表达外源基因蛋白产物。本发明方法规避了侵染、组织再生和阳性筛选等常规转化方法复杂冗余的流程，实现了在常规遗传转化体系难以进行的植物中高效表达基因瓶颈，所构建的病毒载体具有简单、快速、高效、特异性强、受体基因种类广等特点，为后续在太子参中高效表达具有药用和经济价值的蛋白提供了有效的技术平台。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以太子参TuMV-phe病毒基因为基础修饰改造病毒表达载体的方法，主要适用于太子参TuMV类病毒（TuMV-phe）表达载体的快速改造和构建技术细节流程，同时，本发明所获取的太子参花叶病毒载体适用于以快速太子参和烟草植物作为底盘植物快速高效表达外源蛋白技术关键点和详细流程。

背景技术

植物病毒病虽然对作物产量和品质造成大量损失，但是病毒病在植物基因功能验证中却起着重要的作用。随着越来越多的动植物基因组序列完成测定，分子遗传学的研究重点逐步向基因功能的方向发展。同时，随着基因工程技术的发展，如反转录、体外转录等技术的研发为RNA类的病毒载体的构建提供了有效的技术支持。在对植物病毒深入研究中，研究者基于病毒基因组结构，通过基因替代、基因互补等方法已经构建了大量的植物病毒表达载体。目前，在病毒载体构建运用于基因功能研究的主要类型分为基因过表达和基因沉默两种。其中，以病毒基因组为基础的病毒外源表达载体已经广泛应用于不同病毒和不同的宿主植物。

近年来，多种植物病毒已被用于构建成各种基因表达载体，为植物中外源蛋白的表达提供了新的工具。相较于转基因技术下的基因功能研究，以植物病毒基因组作为自主复制的基因表达载体以下特点：①由于病毒基因组小且结构简单，在进行基因组修饰和构建过程中更易于操作；②构建一组基因验证的周期性较短，接种病毒载体后外源基因通常在2周内就会出现表达；③病毒载体可在植物体内进行大量增值，间接促使插入外源蛋白基因在植物中能大量表达等。随着不同植物中大量病毒基因组信息序列的测序，病毒基因组也相应被修饰改造成各种表达载体、RNAi载体，这些载体被广泛用于表达特定外源蛋白表达或验证植物本源基因的功能，极大的促进了非模式植物功能基因组学的研究。

太子参TuMV-phe病毒为申请人所鉴定和克隆的太子参特异病毒，属于TuMV类病毒，病毒全长9839bp（SEQ ID NO.1），可以转录为一个9,495bp的较长的转录本，进一步翻译成3164 aa的多聚蛋白，多聚蛋白进一步在NIa-Pro切割下形成P1, HC-Pro, P3, 6K1, CI,6K2, NIa-VPg, NIa-Pro, NIb 和 CP 等10个子蛋白，不同多聚蛋白首尾相接处均含有Nla-Pro蛋白酶切割位点。通过这些切割位点，不同蛋白均可以顺利从多聚蛋白集合体中释放出来成为一个单独游离蛋白。这些游离蛋白进一步用于病毒基因组的复制、病毒颗粒的装配以及病毒在植物体内移动。根据TuMV-phe病毒的多聚蛋白间的有秩序的排列规律和蛋白间保守的切割位点，可以人为定向插入一个外源蛋白，伪装成病毒蛋白，镶嵌进入病毒基因组内。同时，在目标插入外源蛋白的2端添加Nla-Pro酶切保守位点，则可以保证外源插入蛋白顺利从多聚蛋白上释放，从而实现目标蛋白的高效、快速合成。

发明内容

本发明的目的是提供一种以太子参TuMV-phe病毒基因为基础修饰改造病毒表达载体的方法，主要是在太子参花叶病核心病原病毒基因组的基础上的特异病毒表达载体改造、构建方法，同时，优化和建立太子参花叶病病毒表达载体在太子参和烟草植物中快速表达外源蛋白的技术流程。本发现所建立的太子参病毒表达载体可以在烟草、太子参2种植物底盘中高效的表达不同外源蛋白基因，无需复杂的组织培养、再生和侵染等复杂流程。

为实现上述目的，采用以下技术方案：