[发明专利]用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体、其构建方法及应用

说明书

本发明属于作物基因工程领域，具体涉及用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体、其构建方法及应用。该载体包含PAB2表达框（序列如SEQ ID NO.1第27至3954位所示）、Super‑GW‑GFP‑3Flag表达框（序列如SEQ ID No.1第3973至7869位所示）和除草剂Basta抗性基因表达框（序列如SEQ ID NO.1第14581至15729位所示）。本发明还提供了利用所述质粒载体构建的重组载体，及其在烟草叶片和模式植物拟南芥中的应用。本发明的质粒载体能够快速、高效的鉴定目标蛋白是否为应激颗粒组分，并且能够成功获得双荧光定位的稳定表达转基因植株。

技术领域

本发明属于作物基因工程领域， 具体涉及用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体、其构建方法及应用。

背景技术

全球气候变暖致使高温天气频繁发生，严重影响植物的生长发育，使农作物严重减产。高温已经成为影响植物生长发育的重要环境因子，分析植物对高温的耐性机制，成为当前亟待解决的科学问题。目前关于植物对高温耐性机制主要集中于热激转录因子的转录激活方面。然而，基因转录水平的变化比其迅速应对逆境胁迫压力所需的时间更长。为了应对这一挑战，植物细胞已进化出另一种保护机制—形成应激颗粒（stress granule）。

应激颗粒的形成是一种重要的转录后和翻译调控机制，当真核细胞受到外界胁迫刺激时，在细胞质中形成一种由翻译起始因子、mRNAs、Poly(A)结合蛋白和RNA结合蛋白等组成的无包膜包被致密颗粒物即应激颗粒。在哺乳动物和酵母细胞中，应激颗粒的形成与神经退行性疾病、癌细胞死亡、病毒感染、免疫反应、细胞凋亡和炎症反应等密切相关。有研究显示植物细胞应激颗粒的形成，会增强植物对高温敏感性，暗示应激颗粒的形成对于植物适应高温逆境具有非常重要的作用。但是，植物中应激颗粒的形成机制、组分以及生物学功能仍知之甚少。

应激颗粒的形成作为细胞抵御外界不利条件，使细胞应激期间的损伤降至最低的一种保护性途径，这一途径会触发将导致大多数mRNAs的翻译受到抑制，而应激解除时被应激颗粒保护的mRNAs又能够被释放并进行翻译，这种翻译重编程允许细胞保存能量及维持细胞内稳态。目前，在哺乳动物和酵母细胞中，应激颗粒的组分及生物学功能已有大量报道，但其在植物中的研究仍然较少，而且目前没有能够快速、高通量地鉴定和分析植物应激颗粒蛋白的双元质粒载体。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种应激颗粒快速、高效、高通量分析的双元Gateway双元质粒载体pSGRB7FWG2，为加速植物应激颗粒的研究提供强有力的工具。

本发明的第一个方面，提供用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体，所述质粒载体为pSGRB7FWG2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述载体包含PAB2表达框、Super-GW-GFP-3Flag表达框和除草剂Basta抗性基因表达框，所述PAB2表达框的核苷酸序列如SEQ ID No.1第27至3954位所示；所述Super-GW-GFP-3Flag表达框的核苷酸序列如SEQ ID No.1第3973至7869位所示；所述除草剂Basta抗性基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No.1第14581至15729位所示。

更进一步的，所述PAB2表达框包括：35S启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第2927至3954位所示；PAB2基因，其核苷酸序列如Seq ID No .1第986至2872位所示；红色荧光蛋白RFP编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第274至952位所示；以及T35S终止子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第27至252位所示；