[发明专利]用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体、其构建方法及应用

权利要求书

1.用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体，其特征在于，所述载体为pSGRB7FWG2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述载体包含PAB2表达框、Super-GW-GFP-3Flag表达框和除草剂Basta抗性基因表达框，所述PAB2表达框的核苷酸序列如SEQ IDNo.1第27至3954位所示；所述Super-GW-GFP-3Flag表达框的核苷酸序列如SEQ ID No.1第3973至7869位所示；所述除草剂Basta抗性基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No.1第14581至15729位所示。

2.根据权利要求1所述的用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体，其特征在于，所述PAB2表达框包括：35S启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第2927至3954位所示；PAB2基因，其核苷酸序列如Seq ID No .1第986至2872位所示；红色荧光蛋白RFP编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第274至952位所示；以及T35S终止子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第27至252位所示。

3.根据权利要求2所述的用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体，其特征在于，

所述Super-GW-GFP-3Flag表达框包括：Super启动子，其核苷酸序列如Seq ID No .1第3973至5105位所示；ccdB序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第6346至6651位所示；GFP-3Flag序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第6818至7600位所示；NOS终止子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第7617至7869位所示。

4.根据权利要求3所述的用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体，其特征在于，所述载体还包含：T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1第14245至14577位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1第7887至8086位所示，所述PAB2表达框、所述Super-GW-GFP-3Flag表达框和除草剂Basta抗性基因表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。

5.权利要求4所述的用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、利用限制性内切酶SacI酶切双元质粒载体PAB2-PB7RWG2，所述PAB2-PB7RWG2是将PAB2基因的CDS序列通过BP反应，构建于入门载体pDONR221载体后，再通过LR反应连接到pB7RWG2载体获得的；

S2、以质粒载体pSuper-GW-GFP-3Flag为模板，利用引物SG-Maker-F：gaccatatgggagagctcgcccggttattgttaagctc和SG-Maker-R：caagctcaagctaagcttatgattacgaattcccgatc扩增Super-GW-GFP-3Flag阅读框；

S3、将Super-GW-GFP-3Flag阅读框连接到PAB2-PB7RWG2质粒中并转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，在壮观霉素Spe抗性LB平板中筛选目标克隆子，通过PCR验证和测序分析，最终完成目标质粒载体pSGRB7FWG2的构建。

6.权利要求1所述用于植物应激颗粒相关蛋白快速鉴定的Gateway双元质粒载体在鉴定植物叶片表皮细胞或原生质体中应激颗粒的应用，其特征在于，包括：将目的基因连接到Gateway入门载体并测序，将测序正确的含目的基因的Gateway入门载体与权利要求1的双元质粒载体pSGRB7FWG2进行Gateway克隆的LR反应，反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在壮观霉素Spe抗性LB平板中筛选目标克隆子，通过PCR验证，完成重组载体的构建，将所述重组载体通过农杆菌介导瞬时转化表达，表达于烟草叶片表皮细胞或原生质体中，通过激光共聚焦显微镜分析，正常条件下和逆境胁迫条件下，目的蛋白与PAB2蛋白的荧光共定位情况，确定目标蛋白是否为应激颗粒组分。