[发明专利]一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法，本发明将BRS3基因进行分段，通过分段克隆和基因拼接法获得猪BRS3基因序列，弥补了BRS3基因在猪上研究的空白。本发明又通过以克隆的各片段混合DNA为模板，成功扩增获得猪BRS3全长CDs序列片段，并构建到克隆载体上，为BRS3基因的过表达和干扰序列筛选等以BRS3基因CDs序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法。

背景技术

蛙皮素(Bombesin，Bn)最初是从欧洲青蛙皮肤分离的酰胺化十四肽。随后，在哺乳动物中人们发现了胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide，GRP)和神经介素B(Neuromedin B，NMB)两个蛙皮素样肽。哺乳动物蛙皮素受体属于G-蛋白偶联受体，包括NMB受体(NMBR)、GRP受体(GRPR)和蛙皮素受体亚型3(bombesin receptor subtype 3，BRS3)。由于BRS3没有发现其内源性配体，又称为孤儿受体。虽然，还未发现BRS3的内源性配体，但是研究表明BRS3具有重要的生理功能，包括：影响肿瘤生长/分化，调节能量平衡和糖代谢，通过摄食调节饱腹感，调节体重、血压和心率，调节激素分泌等。

自BRS3发现以来，国内外研究者对BRS3的研究主要集中在人、大小鼠上，发现BRS3在中枢神经组织(CNS)和多种外周组织器官中有表达，尤其是在肿瘤和肺的发育高表达。猪是我国主要的经济家畜和人们动物蛋白的主要来源之一，也是一种重要的模型动物，保证猪的健康，提高猪的生产性能和繁殖能力，是畜牧兽医工作的重要责任，也为进一步研究人类疾病提供重要的参考价值。因此，克隆猪BRS3基因(包括全长CDs序列)为研究BRS3在猪体内的功能具有重要意义。通过对猪BRS3基因预测序列的分析，发现其CDs序列全长为1200bp。尽管猪BRS3基因序列并不是特别长，但是采用常规方法扩增起来却很难成功，即使更换多种高保真扩增酶也未成功，测序后发现和预测相差甚大，由于BRS3基因和其他基因的同源性较高，扩增较长序列很容发生错配，要么扩增出其他基因，要么扩增出的序列只包括部分BRS3序列，故不能使用。因此，使用直接扩增法未能得到有效的BRS3基因序列，很难实现对CDs序列全长的一次性扩增，猪BRS3基因目前还未有人成功克隆。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明通过减少扩增片段长度来提高扩增成功率，采用分段克隆和基因拼接获得猪BRS3基因(包括全长CDs序列)，随后扩增获得BRS3全长CDs序列，并构建到克隆载体上，为BRS3基因的过表达和干扰序列筛选等以BRS3基因CDs序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案得以实现：

一种猪BRS3基因，所述基因CDs序列如SEQ ID NO：4所示。

一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法，将BRS3基因进行分段，通过分段克隆和基因拼接法获得猪BRS3基因序列。

进一步的，将BRS3基因分为三段序列，分别为fragment 1、fragment 2和fragment3；fragment 1、fragment 2和fragment 3彼此部分重叠，三段序列基因拼接后能够获得包含完整CDs序列的猪BRS3基因；fragment 1序列的5’端包括CDs序列的5’端，fragment 1序列的3’端和fragment 2序列的5’端部分序列重合，fragment 2序列的3’端和fragment 3序列的5’端部分序列重合，fragment 3序列的3’端包括CDs序列的3’端。

进一步的，fragment 1、fragment 2和fragment 3的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示。