[发明专利]一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条

说明书

本发明涉及一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条。所述该检测试纸条由布鲁氏菌抗原检测试纸条和塑料吸头组成，检测试纸条由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。采用4株结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体夹心法，其中金标垫包被胶体金标记的布鲁氏菌单克隆抗体4D7，检测线包被布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液，质控线包被山羊抗鼠IgG抗体。本发明的布鲁氏菌抗原的检测试纸条能现场快速检测牛种、羊种、猪种布鲁氏菌，并有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌抗原检测的干扰。试纸条灵敏度和敏感性高，特异性好，使用简便，适用于临床组织、环境、奶液等样本的检测，也适用于纯培养布鲁氏菌的鉴定。

技术领域

本发明涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法——一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，属免疫检测技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人畜共患传染病，WHO将布鲁氏菌病视为“世界范围内流行最广泛的人畜共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”。布病主要是通过直接或间接接触染病动物或动物产品而感染。人类患布病后，会引起发热、肌肉和关节疼痛等，严重者完全丧失劳动能力；家畜感染布病则引起流产和不育，给养殖业造成巨大的经济损失，严重威胁人类食品安全和公共卫生安全。

准确诊断是布病防控极为重要的环节。布病诊断又分为血清学诊断和病原学诊断，相对于常用的布病血清学诊断方法，布病病原学诊断对实验室生物安全级别和实验人员要求都比较高。目前布病病原学诊断方法主要包括细菌分离、生化鉴定分型、核酸检测等，其中核酸检测又有AMOS-PCR、Bruce-ladder PCR、real-time PCR、MLVA等方法。而上述病原学诊断方法的开展都需要在专业布病实验室完成，操作人员必须经过专门培训，一次检测至少需要2小时以上。因此开发针对布病的病原学现场快速诊断方法十分必要。

胶体金免疫层析技术因具有操作简单、快速灵敏、易于判定的优点，在疾病的病原学现场快速诊断中得到了广泛应用。虽然已有布鲁氏菌抗原检测试纸条发明专利的报道，如中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所端青等(申请号200610076701.9)以免疫布鲁氏菌抗原的家兔多抗血清标记胶体金，并以此多抗血清包被检测线，众所周知，以多抗夹心法检测抗原，存在的主要问题是特异性下降，如果多抗血清的效价不高，同时可导致敏感性下降。北京庄迪浩禾生物医学科技有限公司刘明(申请号200810112730.5)采用布鲁氏菌bp26单抗标记胶体金，bp26多抗包被检测线捕获布鲁氏菌抗原。根据文献报道，布鲁氏菌感染羊/牛，其产生针对bp26(编码OMP28外膜蛋白)的抗体具有不确定性，提示针对bp26编码蛋白的单抗对布鲁氏菌的反应性同样具有不确定性。另一方面，仅仅由bp26单克隆抗体捕获完整的布鲁氏菌颗粒抗原，显然存在因捕获能力不足导致的敏感性不高的问题。杭州迪恩科技有限公司张明洲等(申请号201310033074.0)采用牛布鲁氏菌抗体标记胶体金仅能检测牛血液样品中的布鲁氏菌抗原，不能实现对其他易感动物的检测是该方法的局限。杭州奥泰生物技术股份有限公司陈金树等(申请号201911398504.2)采用布鲁氏菌单抗与多抗夹心法检测布鲁氏菌，和上述其他方法一样其方法的敏感性与特异性均不高。

噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘洗的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的特异性结合噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合与扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。