[发明专利]一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条

权利要求书

1.一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于该试纸条由布鲁氏菌抗原检测试纸条和塑料吸头组成；检测试纸条由PVC底板(7)、样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)组成，其中金标垫(2)包被胶体金标记的布鲁氏菌单克隆抗体4D7，检测线(5)包被结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液，质控线(6)包被山羊抗鼠IgG抗体。

2.如权利要求1所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述胶体金标记垫包被有布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物。

3.如权利要求2所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物的制备方法为：

(1)将单克隆抗体4D7株制备的小鼠腹水使用Protein A亲和层析柱进行纯化；

(2)取10mL胶体金溶液至离心管中，加入适量0.1M K₂CO₃调节胶体金溶液pH值至8.0。加入用0.01M PBS稀释1∶160的单克隆抗体4D7 1mL，室温孵育20min。加入牛血清白蛋白至终浓度为0.2％，充分混匀。用超低温冷冻离心机4℃10000r/min离心40min，弃上清。沉淀用0.02M磷酸盐缓冲液重悬至1mL，制得布鲁氏菌单克隆抗体4D7-胶体金标记物。

4.根据权利要求1所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述检测线包被结合不同抗原表位的布鲁氏菌单克隆抗体2B5，5F3，6C2混合液。

5.根据权利要求2和4所述一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条，其特征在于所述布鲁氏菌单克隆抗体4D7、2B5，5F3，6C2的制备与抗原表位鉴定方法为：

(1)用猪种布鲁氏菌S2灭活菌液(1×10¹⁰CFU/mL)作为免疫小鼠所用抗原，经过3次常规免疫后进行加强免疫。加强免疫后72～96小时取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用LPS包被的96孔酶标板作间接酶联免疫吸附试验筛选与猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5、牛种布鲁氏菌A19的LPS均具有强反应，而与大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9的LPS几乎无反应的阳性杂交瘤细胞株，并通过Western-blot试验筛选出4株针对不同反应位点的细胞株4D7、2B5、5F3、6C2。将其扩大培养并纯化，制得4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2；

(2)利用噬菌体肽库展示技术，将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2用0.1M NaHCO₃稀释至100μg/mL，包被ELISA板，每孔加入150μL，4℃孵育过夜。弃去包被液，加入封闭液4℃作用1h，洗板后加入100μL含有4×10¹⁰噬菌体TBST缓冲液，室温摇动孵育1h。弃去未结合噬菌体后洗板。加入100μL含100μg/mL相应单克隆抗体溶液，竞争性洗脱结合的噬菌体，转入大肠杆菌扩增培养后提取噬菌体。按上述方法经过5轮淘洗后，分别获得4株单抗筛选富集的噬菌体，滴定后，每株随机挑选10个单个噬菌斑扩增培养并提取DNA测序。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合的抗原表位核心序列分别为：KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI、TQRIHMRLTTQS、NLSSMSTRSQRR。将以上蛋白序列在NCBI进行BLAST，分别与猪种布鲁氏菌的γ-谷氨酰γ-氨基丁酸水解酶家族蛋白、3-氧基-(酰基载体蛋白)还原酶、ABC-F家族ATP结合蛋白质、双鸟苷酸环化酶蛋白序列同源，均为布鲁氏菌保守序列；

(3)将4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2稀释至5μg/mL并包被ELISA板，每孔加入100μL，经封闭洗涤后，分别加入不同抗原核心序列的4株噬菌体100μL(含5×10⁴个噬菌体)，即每株单抗均分别与4株噬菌体反应，洗板后每孔加入10000倍稀释HRP-羊抗M13单克隆抗体，经显色后读取OD_450nm值。4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2仅与表达其抗原表位核心序列的噬菌体具有强反应，与其他3株噬菌体几乎无反应，证实4株单克隆抗体4D7、2B5、5F3、6C2结合不同抗原表位。