[发明专利]一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明为了解决现有的褐藻胶裂解酶突变体无法满足工业化生产需求的问题，使用生物信息学软件，通过同源建模、蛋白质表面氨基酸确定、序列比对等方法确定若干个位于非保守区域的蛋白表面酸性氨基酸，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶的第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，得到了一种催化活性/效率提高，温度稳定性好，终产物单一性好，利于减少工业化生产中后续产物的纯化成本的褐藻胶裂解酶突变体，为褐藻胶裂解酶突变体进一步工业化应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

褐藻富含海藻酸盐、海带素、海藻多糖及甘露醇，是一种具有巨大产业价值的海洋作物。其中关于甘露醇和海藻多糖的研究已被广泛报道，相关技术较为成熟。与之不同的是关于海藻酸盐(海藻酸钠)的研究相对较少，加之海藻酸盐由于其分子量大，在水中溶解度低的特点无法被广泛应用。因此，如何实现海藻酸盐的高效降解，并使其实现工业化应用是目前研究的热点。

海藻酸钠是主要由α-L-古罗糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)通过糖苷键连接的线性多糖，褐藻胶裂解酶(Alginate lyase)能够通过β-消除反应裂解GM\MG、MM、GG单元间的糖苷键降解海藻酸钠，显著降低其粘度，并最终在降解产物非还原端形成不饱和双键，生成具有优良生理活性的褐藻寡糖。褐藻寡糖具有出色的抗氧化活性，能够通过提高体内抗氧化酶的活性来清除体内的自由基。此外，褐藻寡糖还兼具抑菌与益菌活性。褐藻寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌乃至真菌均有一定抑制作用。研究发现，褐藻寡糖对嗜水气单胞菌、白色念球菌具有较强的抗菌作用。与此同时，褐藻寡糖也能够调节肠道菌群，促进益生菌的增值。其优良的生物活性使其愈发成为当下相关研究的热点。

褐藻胶裂解酶来源广泛，迄今为止已经从多种海洋藻类、海洋软体动物(例如Littorina spp., Haliotis spp.,Turbo cornutus.等)以及一系列的海洋和陆地微生物中鉴定出分属于8个不同家族的褐藻胶裂解酶。然而，由于其来源环境等因素的影响，目前为止能够应用于工业环境中的褐藻胶裂解酶少之又少，大多数褐藻胶裂解酶的性质往往无法满足工业化生产需求。因此，通过基因工程、酶工程手段，对已有的褐藻胶裂解酶进行改造，提高褐藻胶裂解酶的催化性能成为了当前的一个重要研究热点。

发明内容

本发明为了解决现有褐藻胶裂解酶无法满足工业化生产需求的问题，提供了一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，所述技术方案如下：

本发明第一个目的在于提供一种褐藻胶裂解酶突变体，所述突变体是以氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶为亲本，将亲本第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，获得的褐藻胶裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述。

本发明的第二个目的在于提供编码所述褐藻胶裂解酶突变体的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的在于提供携带所述基因的质粒。

本发明的第四个目的在于提供表达所述突变体或携带所述基因的重组细胞。

本发明的第五个目的在于提供一种制备褐藻寡糖的方法，所述方法以海藻酸钠水溶液为底物，添加所述褐藻胶裂解酶突变体，催化获得褐藻寡糖。

在本发明的一个实施方式中，所述海藻酸钠水溶液的浓度为0.2％～0.3％，所述褐藻胶裂解酶突变体的添加量为0.9U/g底物～1.2U/g底物。

在本发明的一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶突变体的添加量为1.08U/g底物。

在本发明的一个实施方式中，所述催化是在32℃～35℃反应4h～7h后，终止反应。

本发明的第六个目的在于提供所述的褐藻胶裂解酶突变体，或所述基因在生产褐藻寡糖中的应用。