[发明专利]保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法

说明书

本发明涉及肉碱对映体拆分方法和保健食品中的肉碱含量检测方法，尤其涉及一种保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱的含量的测定方法。该方法采用超高效合相色谱法拆分肉碱对映体，并测定了保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱对映体的残留量。样品经无水乙醇超声提取，衍生化后，Acquity Trefoil CEL1手性色谱柱分离，以超临界二氧化碳‑1%(v/v)氨水甲醇等助溶剂为流动相进行梯度洗脱，外标法定量。本方法具有快速准确、分离效率高、重复性高、稳定性好等特点，可用于同时测定保健食品中左旋肉碱含量与纯度的分析，为手性药物开发、使用及相关法规的制定提供科学支撑。

技术领域

本发明肉碱对映体拆分方法和保健食品中的肉碱含量检测方法，尤其涉及一种保健食品中左旋肉碱和右旋肉碱的含量的测定方法。

背景技术

肉碱的化学名称为β-羟基-γ-三甲胺基丁酸,其分子中含有1个手性碳原子(见图1),有两个立体异构体：包括右旋肉碱(D-肉碱)对映异构体和左旋肉碱(L-肉碱)对映异构体。其中左旋肉碱(L-Carnitine)，又称卡尼丁或L-肉碱，广泛分布于肝脏器官中，，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸^[1]，同时也是脂肪酸在线粒体内代谢的必需物质,其缺乏可直接导致能量的合成不足,出现易疲劳、肌无力等症状。目前，市售保健品中所用的左旋肉碱主要来源于工业上的化学合成法，但该方法生产出来的L-肉碱纯度通常达不到要求，导致左旋肉碱保健品中含有D-肉碱^[2]。而D-肉碱不但没有功效，甚至具有毒性。人摄入D-肉碱，肌肉会受到损害，造成肌无力，肌疼痛，肌萎缩等症状^[3]。因此，迫切需要建立一种测定保健食品中L-肉碱的含量与纯度的分析方法。

目前L-肉碱的检测方法主要为分光光度法^[4-5]、高效液相色谱法(HPLC)^[6-7]、高效液相色谱-串联质谱法^[5,8-10]等。但这些报道的方法基本都是笼统的检测L-肉碱含量，而对D- 肉碱和L-肉碱的两种对映体的拆分以及L-肉碱的纯度分析的方法报道较少。翟旭峰^[11]和祝伟霞^[2]等采用反向高效液相色谱法实现了左旋肉碱和右旋肉碱的基线分离，但这些方法通常存在分析时间长、有机试剂消耗量大等问题。近年来超高效合相色谱(UPC²)受到了广泛关注，该技术是将超高效液相色谱(UPLC)与传统超临界流体色谱(SFC)的技术特点相互补充，改进了传统SFC的各项硬件^[12]，利用超临界二氧化碳与少量有机溶剂(乙腈、甲醇、异丙醇等)为流动相，能更精确的通过调节控制微小的色谱柱温度、系统背压、流动相的变化来获得所需要的系统分辨率，从而精准调控待测物的保留时间和分离度，提高了系统的精密度、稳定性和可靠性^[13]。研究表明，UPC²技术更适合于分析传统液相色谱难以处理的结构类似物和同分异构体，已成功用于三唑类农药^[14]、酚酸类化合物^[15]、色素^[16]、酚类精油^[17]等。目前，UPC²技术应用于肉碱对映体的拆分和含量测定鲜有报道。

发明内容

为了解决上述常规液相色谱法拆分对映体存在的问题，本研究建立了一种超高效合相色谱法拆分肉碱的两种对映体及测定其对映体在保健食品中含量的方法。实验考察两种肉碱对映体标准品衍生产物的稳定性，优化保健食品中肉碱对映体的提取方法、衍生条件以及仪器色谱分离条件等主要参数，并利用所建立的优化方法对肉碱外消旋体标准品和市售保健食品进行分析测定。同时考虑到保健食品样品中右旋肉碱为有毒副产物，含量较低；左旋肉碱为主含量，含量很高，因此设定右旋肉碱的LOQ为10mg/kg，左旋肉碱的LOQ提高至 50mg/kg。该方法具有分析速度快、分离效果好、有机溶剂消耗少，灵敏度高等特点，为保健食品中L-肉碱含量与纯度的测定提供了参考方法。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：