[发明专利]检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法。该核酸探针组合包括一组或多组多重特异性引物组合，和/或顺序固定于膜芯片表面的一条或多条探针组合；所述引物组合包括生殖道常见病原体的引物和内源对照GAPDH基因的引物；所述探针组合包括生殖道常见病原体特异性探针、阳性杂交点探针和内源对照GAPDH基因的探针。本发明采用多重PCR与反向斑点杂交结合技术，解决常规引物和探针对生殖道病原体检测准确率低以及难以实现7种以上生殖道病原体单反应体系平行检测的问题，克服了现有技术多重反应体系容易交叉污染出现假阳性，准确性低的缺陷，具有检测快速、操作方便、准确度和灵敏度高、特异性好、检测结果可视等优点。

技术领域

本发明属于生物诊断检测技术领域。更具体地，涉及一种快速检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法；具体涉及人型支原体/奈瑟淋球菌/沙眼衣原体/解脲脲原体/生殖支原体/人巨细胞病毒/单纯疱疹病毒Ⅱ型的鉴定方法、引物、探针和试剂盒。

背景技术

生殖道感染(Reproductive Tract Infection，RTI)是妇女的常见病和多发病，是由于受细菌、病毒、支原体、霉菌、滴虫等多种病原体的侵袭而引起女性生殖道感染的一大类传染病的总称，包括阴道炎、外阴炎、盆腔炎等感染。女性生殖道感染是全球性的社会及公共卫生问题，具有发病率高、复发率高、流行范围广的特点。生殖道感染是多种疾病的源头，如果得不到及时诊断和正确治疗，可使艾滋病和宫颈癌的发生风险增加，以及引起不孕症，异位妊娠、流产、死胎、死产、早产、先天感染及新生儿感染、慢性腹痛等并发症，严重影响健康。世界卫生组织发布的数据表明，中国每年至少有2亿女性患生殖道感染及相关疾病。另据统计表明，妇产科门诊患者中，生殖道感染占55％以上。

生殖道病原体是引起生殖道感染性疾病的主要病因，常见的病原体主要有人型支原体(Mycoplasma hominis,MH)、奈瑟淋球菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium,MG)、人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)、单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex VirusⅡ,HSVⅡ)等。流行病学调查显示，各地病原体检出率均不相同，并且不同年龄段患者容易感染的病原体也不同，另外混合型感染越来越常见，已成为医院妇科、皮肤性病科、泌尿生殖科的常见疾病，为我国重点防治的对象。

核酸杂交技术根据检测目的和方法的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位(原位)杂交。其中，固相杂交又可分为斑点杂交、印迹转移杂交。这类杂交技术的特点是将酶切产物或PCR扩增片断直接点膜或经电泳后Southern转移固定至膜上，再与液相中标记的特异探针杂交，这种杂交模式称为正向分子杂交。但是，应用该法检测待检样品时，一次反应仅能与一种探针杂交，多用于检测样品中所扩增的靶基因有无；如要对多个基因或多个突变位点同时进行鉴定，则需与多种探针一一杂交反应，繁琐而费时，难以满足检测要求。而反向分子杂交是将一系列包括属、群、种特异的寡核苷酸探针固定于膜或微孔板上，再与液相中待检标记的PCR产物杂交。反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)的技术原理是：预先将特定的寡核苷酸探针排列固定于固相载体上，采集待检标本，提取基因组DNA或RNA，应用生物素修饰的特异引物扩增DNA或反转录扩增RNA，使PCR产物带有生物素标记，将PCR产物变性后与固定在膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法检测和判读杂交结果。1989年Saiki等首次结合PCR扩增并应用反向斑点杂交(RDB)方法，即采用PCR-反向斑点杂交(PCR-RDB)技术同时检测全血中β地中海贫血多种基因突变位点，使β地中海贫血基因突变诊断取得了飞跃式进展。由于PCR-反向斑点杂交技术操作相对简便、快速、且价格相对低廉，因而已经在各种检测中应用于基因分型、基因突变检测和病原微生物菌种鉴定等领域。