[发明专利]一种蓝色素的生物制备方法

说明书

本发明公开了一种蓝色素的生物制备方法，以重组大肠杆菌为菌种，活化，活化的大肠杆菌接入发酵培养基上进行扩大培养，然后置于发酵罐中持续发酵，发酵过程中通入无菌空气，并维持发酵液的pH值在6.8～7.2范围内，发酵罐中残糖的含量小于1g/L时补料，继续持续发酵一段时间，分离纯化，得到蓝色素。本发明蓝色素的生物制备方法，实现了蓝色素的大批量生产，且污染较少，经济便捷，适用于化妆品、食品、卫生医疗等领域。

技术领域

本发明涉及一种蓝色素的生物制备方法，属于蓝色素制备技术领域。

背景技术

蓝色素，是一种无毒的微生物天然蓝色素，该染料色光纯正，染色强度大，因其天然无毒，也可应用在食品色素上。其分子式为C₁₀H₈O₄N₄，相对分子质量为248，结构式如下：。蓝色素主要应用于染料行业，目前染料行业所使用的染料仍以工业染料靛蓝为主，但工业靛蓝的生产是以化学合成法为主，所产生的污染较为严重，是工业污染的重要源头之一，微生物发酵生产蓝色素污染较少且成本较低，已逐步成为工业靛蓝的替代方案。

蓝色素，目前的主要生产方式是通过将Indigoidine合成基因插入合适的大肠杆菌表达载体（如pET28）并通过转化将含有目的基因片段的质粒转入表达宿主大肠杆菌之中，一般是采用摇瓶的方式来生产蓝色素，但是不能实现工业化、产业化。为此，本发明探索了一种蓝色素的生物制备方法，能够实现蓝色素的大批量生产，经济、安全，能够较广范围应用。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种蓝色素的生物制备方法，将重组大肠杆菌活化接种后，在发酵罐中发酵、诱导表达、补料发酵，制备得到蓝色素，实现了蓝色素的大批量生产；污染较少，经济便捷，质量安全温度；能够广泛应用于化妆品、食品、卫生医疗等领域。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种蓝色素的生物制备方法，以重组大肠杆菌为菌种，活化，活化的大肠杆菌接入发酵培养基上进行扩大培养，然后置于发酵罐中持续发酵，发酵过程中通入无菌空气，并维持发酵液的pH值在6.8~7.2范围内，发酵罐中残糖的含量小于1g/L时补料，继续持续发酵一段时间，分离纯化，得到蓝色素。

本发明蓝色素的具体制备步骤如下：

（1）菌种活化：将重组大肠杆菌菌种置于温度为35℃~38℃、转速为170~200rpm的条件下进行过夜培养，得到活化的大肠杆菌；

（2）扩大培养：将活化的大肠杆菌接入发酵培养基上进行扩大培养，在温度为35~38℃，直至菌密度OD600值为12~18，得到接种种子液；

（3）发酵：将接种种子液置于发酵罐内进行持续发酵，温度为35~38℃，转速为200~1200rpm，发酵过程中通入无菌空气，发酵通气量为2~7m³/h，并用氨水维持发酵液的pH值为6.8~7.2，直至发酵至发酵罐内的残糖的含量小于1g/L进行补料；

（4）诱导表达：在菌种的生长期，加入诱导剂进行诱导表达蛋白；

（5）补料发酵：检测发酵罐中残糖残氮的含量小于1g/L，手动加入葡萄糖，使氨基氮含量在1~2g/L范围内，继续持续发酵6~10h，温度为35~38℃，转速为200~1200rpm，发酵过程中通入无菌空气，发酵通气量为2~7m³/h，并用氨水维持发酵液的pH值为6.8~7.2，得到含有蓝色素的发酵液；

（6）分离纯化：将含有蓝色素的发酵液冷冻干燥，抽去水分，得到蓝色素粗品，向蓝色素粗品加入温度65~80℃热水进行打浆2h，过滤并用热水洗涤至滤液为中性，将截留的物质经低温烘干，得到蓝色素产品。

其中，在步骤（5）中，含有蓝色素的发酵液中的蓝色素含量为1.95~2.20g/L。