[发明专利]内质网应激对NLRP3影响在心肌缺血的模型构建

说明书

本发明公开了医学模型构建领域的内质网应激对NLRP3影响在心肌缺血的模型构建，以明确细胞焦亡在缺血再灌注损伤中的作用，以及其作用机制，本技术方案采用结扎/松解左冠状动脉前降支的方法建立小鼠心肌缺血/再灌注损伤的在体模型，通过对培养的心肌细胞进行缺氧和复氧以构建心肌缺血/再灌注损伤的体外模型，随后在实验过程中干预钙蛋白酶来调控内质网应激，最终通过比较心肌梗死面积及NLRP3蛋白表达水平明确钙蛋白酶调控内质网应激介导细胞焦亡在缺血性心肌损伤中的作用。本技术方案中主要用心肌缺血再灌注模型证实心肌缺血中焦亡的存在和内质网应激于心肌缺血模型中的作用。

技术领域

本发明属于医学模型构建领域，具体是内质网应激对NLRP3影响在心肌缺血的模型构建。

背景技术

对于心肌梗死患者，尽早有效地恢复缺血心肌血液供应是阻止缺血性心肌损伤的发展、减小梗死面积进而改善临床预后的根本措施。但是，心肌缺血再灌注损伤已经成为制约缺血心肌从再灌注治疗中获益的难题。国内外对于心肌缺血再灌注损伤机制已进行了广泛深入的研究，但具体机制仍不十分清楚。因此，进一步深入研究缺血再灌注损伤的发生、发展机制对于其预防，具有重要的临床意义。

近年来细胞焦亡在缺血再灌注损伤中的作用倍受关注，但其作用机制不明。我们从以下几个方面去验证细胞焦亡在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制：①抑制焦亡后检测心肌梗死面积、心功能指标及心肌损伤指标的变化，阐明心肌细胞焦亡在心肌缺血再灌注损伤中的作用。②干预NLRP3表达后检测心肌细胞焦亡、心肌梗死面积、心功能指标及心肌损伤指标的变化，阐明缺血再灌注时NLRP3对心肌细胞焦亡的调控作用。③调控calpain后观察缺血再灌注后心肌梗死面积、心功能、心肌损伤指标、NLRP3蛋白表达、内质网应激及心肌细胞焦亡指标的变化。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种模型以明确细胞焦亡在缺血再灌注损伤中的作用，以及其作用机制。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：内质网应激对NLRP3影响在心肌缺血的模型构建，采用体内外模型进行缺血再灌注以构建心肌缺血模型，随后在实验过程中调节钙蛋白酶的含量变化以改变内质网应激的稳定性，最终通过比较心肌梗死面积和NLRP3蛋白表达水平以实现模型的论证作用。

进一步，包括以下步骤：

S1,进行体内外模型的缺血再灌注处理时通过Tunel及PI染色以检测心肌细胞是否引起焦亡；

S2,随后对缺血再灌注的模型以检测GRP78及CHOP的变化以论证内质网应激的存在与否；

S3,利用caspase-1的抑制剂Ac-YVAD-CMK减轻焦亡，随后记录观察PI染色阳性细胞的活力情况；

S4,同时对离体的心肌细胞与在体的心肌细胞进行缺血再灌注处理，观察NLRP3炎症小体的激活情况；

S5，在动物实验过程中通过TTC染色检测心肌梗死面积，并通过钙蛋白酶的抑制剂PD150606对钙蛋白酶活性进行干预；

S6，通过比较钙蛋白酶变化情况及不同情况下的心肌梗死面积，明确钙蛋白酶与内质网应激变化的关系。

进一步，所述步骤S1中PI染色主要观察阳性细胞比率，并观察Caspase-1和IL-1β的变化情况。

进一步，所述步骤S2中区分为YVAD+缺血再灌注组和缺血再灌注组，对比PI染色阳性率情况。

进一步，所述步骤S4中用NLRP3siRNA抑制NLRP3炎症小体的活化来做进一步检测。

进一步，所述S6中进行MCC950抑制NLRP3炎症小体的活化，论证缺血再灌注引起的心肌细胞焦亡与NLRP3炎症小体的关系。